陳明治，徐偉，王建，周健，林杰，馮子旺，蔣國軍

（江蘇大學附屬宜興人民醫(yī)院 心胸外科,江蘇 宜興 214200）

食管癌是嚴重威脅人類生命健康的一種疾病,其死亡率居全球第6 位,發(fā)病率和病死率仍逐年升高。盡管過去幾十年惡性腫瘤的診療手段有了很大的進步,但食管癌的預后仍然很差,尋找食管癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵因素,為食管癌的診療提供新的有效靶點成為目前亟待解決的重要難題。MicroRNAs（miRNAs）是一類總長19～25 個核酸組成的內(nèi)源性小片段非編碼RNA,參與多種生理、病理學過程［1-3］。

目前發(fā)現(xiàn)多種miRNA 在食管癌中的表達顯著改變。GUO 等［4］研究發(fā)現(xiàn),在ESCC 組織中有46種miRNA 表達異常,其中7 種miRNA 可以作為食管癌的腫瘤標志物。LIU 等［5］研究發(fā)現(xiàn),ESCC中miRNA-146a 的表達顯著下調(diào)。在細胞系TE-1和Eca109 中,過表達miRNA-146a 可以抑制細胞的增殖和侵襲。miR-26a 已證實在多種腫瘤中（如肝癌、間充質(zhì)癌及前列腺癌等）表達異常,與腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡等密切相關(guān),但其在食管癌組織中的表達水平尚不明確。本研究對ESCC 組織和細胞中miR-26a 的表達及其與ESCC細胞的生物學行為、患者臨床組織病理學特征間的關(guān)系進行系統(tǒng)研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年1 月至2018 年12 月在江蘇大學附屬宜興醫(yī)院進行食管癌根治術(shù)的45 例患者。其中,男性26 例,女性19 例；年齡42～74 歲,平均（63.6±9.7）歲。取術(shù)中切除腫瘤樣本中心處樣本作為實驗組,另外在術(shù)野上緣取正常食管上皮組織作為對照組。標本取材后均于10 min 內(nèi)置于液氮組織中速凍,2 h 后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱長期儲存,并且收集相應(yīng)患者的臨床病史資料,包括食管癌患者確診時的年齡、性別、腫瘤大小、術(shù)后腫瘤分化程度、腫瘤浸潤及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。納入標準：①臨床診斷和病理學診斷確診為ESCC；②患者及其家屬知情同意。排除標準：①術(shù)前有放化及其他方式治療史；②高血壓、糖尿病及心腦血管意外等合并病史；③術(shù)后病理報告見切緣存在腫瘤受累。

細胞系獲?。簝煞N人ESCC 細胞系（TE-1 細胞和Eca109 細胞）及正常人食管鱗狀上皮細胞系（HEEC）均經(jīng)上海中科院細胞庫代理購自美國模式培養(yǎng)物集存庫,miRcute miRNA 分離提取試劑盒、miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA PCR 擴增試劑盒均購自北京天根生物科技公司,Cell Counting Kit-8 試劑盒、Annexin V-FITC PI 細胞凋亡檢測試劑盒均購自德國CST 股份公司,6×DNA loading buffer 購自日本Takara 株式會社。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 使用miRcute miRNA 分離提取試劑盒提取食管癌和正常食管組織中miRNA,操作按照廠家提供的說明書進行。總RNA 純度及濃度測定：取1 μL 上述RNA 溶液加入199 μL DEPC 中,采用紫外分光光度法檢測其在260 nm 和280 nm 波長處的紫外吸收值,并記錄儀器給出的RNA 濃度。光密度（OD）260/280 反映RNA 樣本純度,這一比值在1.8～2.0 表示RNA 樣本純度較好。反轉(zhuǎn)錄互補DNA（cDNA）：按照北京天根生物公司miRNA cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明書,對上述抽提的miRNA 的3'端進行poly A 尾的加尾處理,然后利用加尾后的miRNA 進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄條件：42℃×60 min→72℃×10 min。反轉(zhuǎn)錄體系20μL：Oligo（dT）18（1μg/μL）1μL,總RNA2μg,65°C 5 min,轉(zhuǎn)入4°C 后加入5×擴增緩沖液4 μL,10 mM dNTPs 1μL,RNA Inhibitor（40 u/μL）1μL,M-MLV （200 u/μL） 1 μL。引物設(shè) 計：通 過miRBase 檢索人miR-26a 的序列并通過blast primer進行引物設(shè)計。miR-26a 引物序列,正向引物：5'-GACGGTTCAAGTAATCCAGG-3',反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。qRT-PCR：參照北京天根生物科技公司miRNA PCR 試劑盒中步驟,逐步操作,擴增組織或細胞中的miR-26a。取適量合成的cDNA 為模板進行PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系為20μL：2×Master Mix 10μL,5μM 引物（正反向引物混合）0.8 μL,cDNA 產(chǎn)物2 μL,SYBR Green 0.8 μL。

1.2.2 CKK-8 法檢測細胞活性 細胞增殖速率通過Cell Counting Kit-8 試劑盒來檢測,細胞消化后按每孔約3.0×103加入96 孔板中,培養(yǎng)箱中孵育過夜；每孔中加入10 μL CCK 溶液,避光在孵育2 h；用酶標儀測定各孔在450 nm 處OD 值。細胞活力的計算公式如下：

1.2.3 細胞凋亡檢測 通過Annexin V-FITC PI 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況,細胞消化后按每孔約2.0×104加入48 孔板中,培養(yǎng)箱中孵育24 h 后,消化脫落后2 000r/min 室溫離心5 min,棄上清；細胞沉淀加入200 μL PBS 溶液,輕柔吹打均勻后,2 000r/min 室溫離心5 min；重復1～2次。加入5 μL Binding buffer 輕柔吹打均勻使細胞懸?。患尤? μL Annexin V-FITC 混合均勻后,再加入5 μL Propidium Iodide 混勻,室溫、避光,靜置反應(yīng)5～10 min（需1 h 內(nèi)完成后續(xù)實驗）。用流式細胞儀檢測,激發(fā)波長Ex=488 nm,發(fā)射波長=530 nm,Annexin V-FITC 的綠色熒光通過FITC 通道（FL1）檢測,PI 的紅色熒光通過FL3 通道檢測。

1.2.4 細胞周期分析 細胞消化后按每孔約2.0×104加入48 孔板中,培養(yǎng)箱中孵育24 h 后,消化脫落后2 000 r/min 室溫離心5 min,棄上清；細胞沉淀加入200 μL PBS 溶液,輕柔吹打均勻后,2 000 r/min室溫離心55 min,重復1、2 次。加入預冷的70%乙醇,4℃靜置過夜后離心收集細胞,1 mL PBS 溶液洗滌細胞1 次,2 000 r/min 離心去上清；加入500 μL 染色液（其中含50 μg/mL 溴化乙錠溶液、100 μg/mL RNase A、0.2%Triton X-100）,4℃避光孵育30 min。以標準程序用流式細胞儀檢測,結(jié)果用細胞周期擬合軟件分析。

1.2.5 細胞集落形成實驗 細胞消化后反復吹打使細胞充分分散,顯微鏡下見單個細胞百分率＞95%；將細胞稀釋至約每毫升100 個細胞,取5 mL 細胞懸液加入6 cm 培養(yǎng)皿中,以十字方向輕柔晃動培養(yǎng)皿,使細胞分布均勻,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周；棄去培養(yǎng)基,用PBS 溶液小心清洗2、3 次后甲醇固定15 min,棄除甲醇后室溫自然干燥,用0.04%結(jié)晶紫染色,用Omnicon 3600 image 軟件計數(shù)直徑＞50 μm 的細胞集落。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示,通過方差齊性檢測確定多組樣本間符合方差齊性,進而使用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計；計數(shù)資料以率（%）表示,比較用χ2進驗,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 組織和細胞中miR-26a 的表達顯著下調(diào)

與癌旁正常食管組織比較,腫瘤組織中miR-26a 的表達顯著下調(diào)（見圖1A）。同時通過自身對照,逐一比較了每個患者腫瘤組織和癌旁正常組織中miRNA-26a 的表達,發(fā)現(xiàn)約93.3%患者存在腫瘤組織中miR-26a 表達減少（見圖1B）。與食管上皮細胞系相比,ESCC 細胞系TE-1、Eca109 中miR-26a 的表達降低,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 ESCC 患者腫瘤組織和癌旁正常組織中miR-26a 的表達

圖2 ESCC 細胞系中miR-26a 的表達

2.2 miR-26a 的表達與ESCC 臨床病理特征的關(guān)系

參照材料方法部分的入選和剔除標準,入選本研究患者45 例。其中,男性26 例（57.8%）,女性19 例（42.2%）；年齡42～74 歲,平均手術(shù)年齡（63.3±9.7）歲。腫瘤組織中miR-26a 的低表達與患者腫瘤大小、腫瘤細胞分化不良、腫瘤浸潤及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量相關(guān)（P＜0.05）,而與患者年齡、性別無關(guān)（P＞0.05）。由此推測,在ESCC 的發(fā)病過程中,miRNA-26a 可能起到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。見表1。

表1 45 例ESCC 患者腫瘤組織中miR-26a 的表達與其臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性分析 （例）

2.3 miRNA-26a 的表達對ESCC 細胞生物學行為的影響

腫瘤的發(fā)生主要是細胞過度增殖和細胞凋亡異常,為了探尋miR-26a 在ESCC 發(fā)生、發(fā)展中的作用,本文進一步研究了miR-26a 與ESCC 細胞增殖和凋亡間的關(guān)系。

2.3.1 miR-26a 過表達能抑制細胞增殖 將細胞分為3 組,分別為空白對照組（WT 組）、空載體轉(zhuǎn)染組（NC 組） 和及miR-26a 轉(zhuǎn)染組（miR-26a組）。利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒,分別檢測各組細胞活力。TE-1 細胞轉(zhuǎn)染后第2 天,單獨轉(zhuǎn)染miR-26a 組細胞存活率較空白對照組、空載體轉(zhuǎn)染組即開始出現(xiàn)下降,第5 天顯著降低（見圖3A）；Eca109 細胞轉(zhuǎn)染后第2 天,單獨轉(zhuǎn)染組細胞存活率開始出現(xiàn)下降,第5 天較空白對照組和空載體轉(zhuǎn)染組細胞活性均顯著下降。提示miR-26a 過表達可以抑制ESCC 細胞的增殖（見圖3B）。

圖3 過表達miR-26a 對ESCC 細胞增殖能力的影響

2.3.2 集落形成實驗 無論是TE-1 細胞,還是Eca109 細胞,過表達miR-26a 組集落形成均顯著減少（見表2 和圖4）,進一步證實了miR-26a 與腫瘤生物學特性間的關(guān)系。

表2 miR-26a 過表達對TE-1、Eca109 細胞集落形成的影響 （）

表2 miR-26a 過表達對TE-1、Eca109 細胞集落形成的影響 （）

注：?與空白對照組比較,P＜0.05。

圖4 miR-26a 對ESCC 腫瘤細胞集落形成的調(diào)節(jié)

2.3.3 各組ESCC 細胞周期檢測 結(jié)果顯示過表達miR-26a 后處于S 期（DNA 合成期）和G2/M期（有絲分裂期）的細胞顯著減少,提示miR-26a可以抑制兩種ESCC 細胞的增殖。見圖5。

2.3.4 過表達miR-26a 可促進ESCC 細胞凋亡細胞凋亡減少也是腫瘤形成機制之一,為檢測miR-26a 是否與ESCC 細胞的凋亡有關(guān),將正常培養(yǎng)的TE-1、Eca109 細胞分為空白對照組（WT組）、空載體轉(zhuǎn)染組（NC 組）和miR-26a 轉(zhuǎn)染組（miR-26a 組）,Annexin V 和PI 雙染對各組細胞的凋亡率進行檢測,結(jié)果顯示miR-26a 過表達后細胞凋亡（包括Annexin V+/PI-象限的早期凋亡細胞和Annexin V+/PI+象限的晚期凋亡細胞）顯著增加,提示miR-26a 可促進ESCC 細胞的凋亡。見圖6。

圖5 過表達miR-26a 對ESCC 細胞周期分布的調(diào)節(jié)

圖6 過表達miR-26a 對ESCC 細胞凋亡的影響

3 討論

腫瘤是一類與眾多編碼致癌蛋白、抑癌蛋白的基因表達失調(diào)有關(guān)的復雜的基因相關(guān)疾病。1993 年LEE 等［6］在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一類特殊的非編碼小RNA 序列（即microRNAs）,通過與互補靶mRNA 結(jié)合導致mRNA 翻譯抑制或降解,其在細胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用［7］。miR26a位于人類3 號染色體,全長21 個核苷酸,在多種組織廣泛表達,其表達無特異性。在不同腫瘤類型中,miR-26a 既有促進癌癥發(fā)生的功能,也有抑制腫瘤發(fā)生的功能。有研究發(fā)現(xiàn),miR-26a 能夠抑制乳腺癌［8］、肝癌［9］和鼻咽癌［10］細胞的增殖。在前列腺癌中,miR-26a 表達異常下調(diào),過表達miR-26a 能夠抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡［11］；但在膠質(zhì)瘤中,miR-26a 卻能促進腫瘤細胞的增殖［12］。在非小細胞肺癌細胞中,miR-26a 能通過作用于PTPNl3 降低癌細胞對酪氨酸激酶抑制劑的敏感性［13］。MiR-26a 的異常表達與甲狀腺癌［8］、肺癌［13］和乳腺癌［14］有關(guān)。肝細胞癌中miR-26a的表達減少,外源性過表達miR-26a 能促進細胞凋亡抑制肝細胞癌進展［15］,本研究選取的食管癌腫瘤及癌旁組織標本45 例,發(fā)現(xiàn)ESCC 患者腫瘤組織中miR-26a 的表達顯著降低,并且93%患者腫瘤組織中存在著miR-26a 表達減少,這一結(jié)果也在ESCC 細胞系TE-1、Eca109 中得到進一步印證,提示miR-26a 在食管癌中可能起到抑癌作用。進一步分析入選患者的臨床資料,發(fā)現(xiàn)miR-26a的表達降低與腫瘤直徑、腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

miRNA 表達異常也與腫瘤分化程度有關(guān),LIN等［16］報道,低分化ESCC 組織中miR-31 的表達顯著低于中分化組和高分化組,同時低分化ESCC 組織中miR-142-3p 表達顯著低于中分化組。本研究通過對ESCC 患者臨床資料的分析,發(fā)現(xiàn)miR-26a表達減少與腫瘤低分化程度顯著相關(guān)。在細胞水平,利用ESCC 細胞系TE-1 和Eca109 細胞,通過轉(zhuǎn)染miR-26a 質(zhì)粒,觀察到過表達miR-26a 能夠降低細胞活性,抑制細胞增殖和集落形成,促進細胞凋亡。此外miRNA 表達異?？赡芘c食管癌的預后有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn),miR-142-3p 高表達是食管癌預后不良有關(guān)［16］,miR-16-2、miR-30e 表達異常也與食管癌患者總生存時長、帶瘤生存率有關(guān)［17］。本研究臨床資料的收集并未隨訪患者預后的相關(guān)資料,可以在以后的研究中進一步補充完整。本研究由于是回顧性分析,且樣本量較少,無法充分控制混雜因素的影響,尚不足以指導臨床實踐,但卻為后續(xù)的臨床和基礎(chǔ)研究提供了有意義的參考。

綜上所述,在ESCC 發(fā)病過程中、ESCC 組織和細胞中,miR-26a 的表達顯著減少,與ESCC 患者腫瘤直徑、腫瘤低分化程度、腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在顯著相關(guān)性。miR-26a 作為一種抑癌因子,可以通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡,從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,有望成為食管癌診療的新的靶點。