班艷芳，董建國，2，范蘭蘭，于林洋，劉獻輝，張鵬飛，劉燕玲，張樂宜，王磊，宋長緒*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東 廣州 5106422.信陽農(nóng)林學院牧醫(yī)工程學院，河南 信陽 464000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征[1]。自2010年10月以來，PEDV變異毒株廣泛流行于國內(nèi)不同地區(qū)，對2周齡以內(nèi)仔豬的危害尤為嚴重，其發(fā)病率和死亡率甚至高達90%～100%，嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2-3]。

PEDV為冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)的成員，病毒形態(tài)呈球形，在糞便中的病毒粒子常呈現(xiàn)多形態(tài)，平均直徑為130 nm(95～190 nm)[4]。PEDV基因組為單股正鏈RNA，長度約為28 kb。基因組分別編碼S蛋白(纖突蛋白)、M蛋白(膜糖蛋白)、E蛋白(小包膜糖蛋白)、N蛋白(核衣殼蛋白)、16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1～nsp16)和ORF3蛋白[5]。其中S蛋白是PEDV主要抗原蛋白，可分為S1和S2結(jié)構(gòu)域，在PEDV入侵過程中，S1結(jié)構(gòu)域與細胞受體相互作用，S2結(jié)構(gòu)域介導病毒與宿主細胞的膜融合過程[3]。鑒定受體是了解病毒的跨種傳播、致病機制和制定干預策略的關(guān)鍵，PEDV的受體研究一直為研究者所青睞[6]。目前有文獻報道豬氨基肽酶N(pAPN)是PEDV的一個功能性受體[7]。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，pAPN蛋白仍不能解釋PEDV感染中存在的相關(guān)理論問題，Vero細胞系常用于PEDV毒株的分離和增殖，但這些細胞并不表達pAPN[8]。這提示PEDV可能不僅僅依賴于pAPN蛋白感染宿主細胞，也可能存在pAPN以外的受體蛋白[9]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，pAPN缺失的新生仔豬可預防豬傳染性胃腸炎病毒，但對豬流行性腹瀉病毒無保護作用，進一步驗證了pAPN不是PEDV的受體[10]。

迄今為止，PEDV相關(guān)的侵入機制和免疫機理尚未明確，因此，對PEDV受體的研究具有重要的科學意義。有研究發(fā)現(xiàn)，甘露糖-6-磷酸/胰島素樣生長因子Ⅱ受體(M6P/IGF2R，簡稱M6PR)在人類醫(yī)學中關(guān)于輪狀病毒的研究比較多，大多數(shù)輪狀病毒株需要與不依賴于陽離子的M6PR(CI-M6PR)才能進入細胞[11]。CI-M6PR的胞質(zhì)外區(qū)有一個重復結(jié)構(gòu)，由15個連續(xù)的重復組成，每個重復約147個氨基酸[12]。然而在豬等其他動物體的研究卻鮮有報道。鑒于此，本試驗通過病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(VOPBA)和質(zhì)譜(MS)技術(shù)，初步探索了不依賴于陽離子的M6P/IGF2R對PEDV感染的影響，為進一步研究PEDV感染細胞的機制和防控PED提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞和質(zhì)粒

PEDV GDgh毒株為本實驗室保存；豬小腸上皮細胞IPEC-J2、非洲綠猴腎細胞Vero E6為實驗室保存；pCMV-PEDV S2-HA質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建保存；鼠源抗PEDV S1單克隆抗體為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

同源重組試劑盒(Vazyme，南京)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒(Promega，北京)；LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent、LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent 轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、PierceTMBCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific，美國)；鼠源抗Flag、HA單克隆抗體(Sigma，德國)；QuickBlockTMWestern一抗稀釋液(Beyotime，上海)；組織細胞RNA提取試劑盒(Magen，廣州)；Premix PrimesSTAR HS高保真酶(TaKaRa，大連)。

1.1.3 主要儀器

超速離心機(貝克曼Optima XPN-100)；場發(fā)射透射電子顯微鏡(型號為Talos F200S，Thermo Fisher Scientific)；激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710)。

1.2 方法

1.2.1 病毒鋪覆蛋白結(jié)合試驗(VOPBA)

取7日齡三元雜交(杜長大)仔豬的新鮮小腸，輕輕刮取上皮黏膜組織，進行蛋白裂解后測定蛋白濃度，制備豬小腸上皮黏膜蛋白。同時制備2塊SDS-PAGE，一塊轉(zhuǎn)印至PVDF膜，另一塊留作分析。小腸上皮黏膜蛋白上樣量為80～100μg/孔，進行SDA-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，在室溫條件下，用含5%脫脂乳的含磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)封閉膜2 h，用含1%脫脂乳的PBS洗滌1次，最后用緩沖液(含1%脫脂乳的PBS,220 mmol/L NaCl)洗滌，將PVDF膜在緩沖液中4 ℃條件下過夜孵育純化的PEDV(20μg總蛋白質(zhì)/mL)，未孵育PEDV為空白對照。將PVDF膜清洗3次，用含0.05% Tween-20的PBST孵育PEDV S1單抗，室溫孵育3 h，孵育羊抗小鼠二抗，然后曝光。將在PVDF膜上獲得的蛋白印跡對應(yīng)膠條切下轉(zhuǎn)移至EP管，送至華大基因公司進行質(zhì)譜分析。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

參照GenBank已發(fā)表的Sus scrofa M6P/IGF2R(AF339885.1)基因序列，通過設(shè)計引物擴增其胞外區(qū)。由于M6P/IGF2R蛋白分子較大，將其分為三段進行擴增，M6P/IGF2R1：1～750 aa，M6P/IGF2R2：678～1546 aa，M6P/IGF2R3：1486～2287 aa，擴增引物見表1。設(shè)計同源引物分別擴增M6P/IGF2R 1～3和pCDNA3.1-3×flag載體，采用同源重組試劑，將M6P/IGF2R三段基因克隆于載體pCDNA3.1-3×flag，同源引物見表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。菌落PCR鑒定陽性克隆并送測序，正確陽性克隆進行質(zhì)粒提取。

表1 用于擴增M6P/IGF2R的引物序列

表2 同源重組引物序列

1.2.3 Western blot

Vero E6細胞接種于6孔培養(yǎng)板，細胞融合達70%～80%時轉(zhuǎn)染，應(yīng)用LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent將構(gòu)建好的pcDNA3.1-M6P/IGF2R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，具體轉(zhuǎn)染操作參照說明書，24 h后收樣，Western blot分析表達情況。

1.2.4 siRNA干擾試驗

IPEC-J2細胞接種于24孔培養(yǎng)板，細胞融合達50%～70%時轉(zhuǎn)染，應(yīng)用LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent將M6P/IGF2R siRNA和陰性對照NC siRNA(吉瑪基因公司合成)轉(zhuǎn)染IPEC-J2細胞。具體轉(zhuǎn)染操作參照公司手冊，siRNA轉(zhuǎn)染量為10 pmol/孔。M6P/IGF2R-siRNA正義序列：5′-CCGAGACACCUGUCUGUAATT-3′，反義序列：5′- UUACAGACAGGUGUCUCGGTT-3′。陰性對照NC siRNA正義序列:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，將細胞收集，進行定時定量PCR(RT-qPCR)檢測干擾效果。細胞分別命名為：NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照 siRNA)、siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R siRNA)。

1.2.5 激光共聚焦試驗

Vero E6細胞接種到共聚焦皿中，讓細胞貼壁生長，將重組質(zhì)粒M6P/IGF2R1～3分別和PEDV S2進行共轉(zhuǎn)染，36 h后棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗一次；4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，10 min/次；0.5Triton X-100室溫透化15 min，PBS漂洗3次；2%BSA室溫封閉30 min，PBS漂洗一次；用一抗稀釋液稀釋一抗(1∶2 000)，4 ℃過夜孵育；PBS漂洗3次；用PBST稀釋熒光標記的二抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗3次；用DAPI等核酸染料染核，工作濃度為1 μg/mL；PBS漂洗3次，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 病毒吸附試驗

Vero E6細胞接種到24孔板中，待細胞長至70%～90%，將構(gòu)建的M6P/IGF2R1～3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞進行過表達；IPEC-J2細胞接種到24孔板中，待細胞長至50%～70%，轉(zhuǎn)染干擾M6P/IGF2R基因的siRNA。轉(zhuǎn)染36 h后將PEDV按照感染比(MOI)=0.1接種分別在4 ℃孵育3 h和37 ℃孵育1 h，在4 ℃孵育時，細胞需提前預冷1 h。孵育完成后，根據(jù)試劑盒說明提取細胞RNA，取500 ng RNA進行反轉(zhuǎn)錄，進行RT-qPCR檢測病毒拷貝數(shù)，基因的相對表達量采用2-ΔΔCt。RT-qPCR引物見表3。

表3 用于檢測PEDV RNA拷貝數(shù)及內(nèi)參的RT-qPCR引物序列

1.2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.000 1為差異極顯著，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 VOPBA篩選受體相關(guān)蛋白

VOPBA結(jié)果顯示，PEDV附著于分子質(zhì)量為250～300 kDa的蛋白條帶之間，未孵育PEDV的對照組未見反應(yīng)(圖1)。為了鑒定該蛋白，將凝膠中對應(yīng)的蛋白條帶切除，用質(zhì)譜法(MS)分析肽質(zhì)量。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白數(shù)據(jù)庫進行比較，在所獲得的肽段中，初步篩選到豬M6P/IGF2R，其分子質(zhì)量與在硝化纖維素膜上檢測到的蛋白大小相似。

圖1 VOPBA結(jié)果

2.2 Western blot分析M6P/IGF2R1～3表達情況

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒M6P/IGF2R1～3分別轉(zhuǎn)染Vero E6細胞進行Western blot檢測，結(jié)果如圖2所示，條帶大小分別為90、104和96 kDa，與預期相符。

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞Western blot檢測結(jié)果

2.3 siRNA干擾M6P/IGF2R表達

IPEC-J2細胞轉(zhuǎn)染干擾M6P/IGF2R的siRNA，收集細胞進行M6P/IGF2R mRNA的RT-qPCR試驗，檢測干擾效果，如圖3所示，與NC組相比，M6P/IGF2R siRNA可顯著降低M6P/IGF2R的mRNA表達水平。

注：****表示兩組間差異極顯著(P<0.000 1)圖3 M6P/IGF2R siRNA干擾效果

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察M6P/IGF2R與PEDV在細胞中表達共定位

將構(gòu)建的M6P/IGF2R1～3重組質(zhì)粒分別和PEDV S2共轉(zhuǎn)染Vero細胞，轉(zhuǎn)染后36 h固定細胞，進行激光共聚焦試驗，結(jié)果如圖4所示，分別共轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1和PEDV S2、M6P/IGF2R2和PEDV S2以及M6P/IGF2R3和PEDV S2的細胞中均出現(xiàn)特異性綠色熒光和紅色熒光，而Mock組細胞沒有出現(xiàn)特異性熒光，DAPI的單色圖中均可見清晰的細胞核，在Merge合成圖中，可見綠色熒光和紅色熒光相重疊，表明M6P/IGF2R和PEDV在細胞中表達共定位，這從一個側(cè)面反映了兩者之間存在相互作用。

圖4 激光共聚焦結(jié)果

2.5 M6P/IGF2R對病毒吸附的影響

2.5.1 過表達M6P/IGF2R促進PEDV吸附Vero E6細胞

Vero細胞分別轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1～3重組質(zhì)粒后，檢測PEDV吸附細胞的病毒拷貝數(shù)，結(jié)果如圖5所示，37 ℃條件下轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1～3和M6P/IGF2R123的細胞中，PEDV的含量相比于對照組有顯著提高，轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R2和轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R3的細胞中PEDV含量與對照組相比無顯著差異。4 ℃條件下分別轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R1～3和共同轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R123時，PEDV在Vero E6細胞上吸附的病毒含量相比于對照組均有顯著提高，表明M6P/IGF2R有促進PEDV吸附的作用。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。下同圖5 37 ℃(A)和4 ℃(B)條件下過表達M6P/IGF2R對PEDV吸附的影響

2.5.2 干擾M6P/IGF2R抑制PEDV吸附IPEC-J2細胞

在IPEC-J2細胞中干擾M6P/IGF2R基因表達后，PEDV吸附結(jié)果如圖6所示，相比對照組，干擾M6P/IGF2R組的PEDV含量在37℃和4℃時均顯著降低，表明M6P/IGF2R有促進PEDV吸附的作用。

圖6 37 ℃(A)和4 ℃(B)條件下干擾M6P/IGF2R對PEDV吸附的影響

3 討論

病毒感染細胞的第一步即病毒與細胞膜表面的受體結(jié)合，受體決定病毒的組織細胞嗜性，識別與病毒結(jié)合的宿主細胞分子將有助于了解病毒的生命周期及其致病機制[13]。M6PRs是一種多功能蛋白，在細胞表面與兩種不同的配體結(jié)合，即攜帶蛋白的甘露糖6-磷酸(M6P)和IGF-II[14]，參與調(diào)控細胞生長和凋亡[15]。CD-M6PR(結(jié)合活性依賴二價離子)和CI-M6PR在皰疹病毒(HSV)1型和2型以及水痘帶狀皰疹病毒在進入細胞和細胞間傳播過程中都起著細胞受體的作用[16]。研究結(jié)果表明，細胞中有大量的M6PR，主要分布在反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)(trans-Golgi network，TGN)、早期內(nèi)吞體、循環(huán)中的內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體及質(zhì)膜，溶酶體中很少或沒有M6PR分布。細胞表面和細胞內(nèi)部的M6PR構(gòu)成了細胞的M6PR池，細胞表面和細胞內(nèi)部的M6PR量保持動態(tài)平衡，二者可相互轉(zhuǎn)換[17]。

VOPBA試驗利用病毒與受體具有高度親和力的特點和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印原理，直接鑒定與病毒結(jié)合的細胞膜受體蛋白，是近年來用于細胞膜表面病毒受體研究的重要方法。病毒與宿主細胞表面受體分子的結(jié)合是發(fā)生病毒侵染細胞的先行條件，病毒在受體的介導下最終進入宿主細胞，從而出現(xiàn)一系列反應(yīng)[18]。鑒于此，本試驗從質(zhì)譜結(jié)果中篩選與VOPBA結(jié)果條帶大小相符且屬于質(zhì)膜的蛋白來探索潛在的靶分子。

本試驗通過VOPBA和質(zhì)譜篩選到目標蛋白M6P/IGF2R，初步將其胞外區(qū)分為3段進行擴增，并構(gòu)建到pcDNA3.1-3×flag真核表達質(zhì)粒上。本試驗激光共聚焦結(jié)果顯示，綠色熒光和紅色熒光能夠重合，表明M6P/IGF2R的3個片段均與PEDV S2蛋白存在共定位現(xiàn)象，說明兩者可能存在相互作用。

PEDV引起的病變主要集中在豬的小腸組織，病毒主要在豬小腸上皮細胞內(nèi)增殖。因此，小腸上皮細胞作為固有層免疫細胞與外環(huán)境間的天然屏障構(gòu)成腸道的第一道免疫防線，但目前在體外培養(yǎng)中，Vero細胞是分離培養(yǎng)PEDV的最適細胞系[19]。本試驗選取最適分離培養(yǎng)PEDV的且易于轉(zhuǎn)染的Vero細胞系進行過表達M6P/IGF2R對PEDV吸附的影響試驗，選取IPEC-J2宿主細胞進行干擾M6P/IGF2R后驗證其對PEDV吸附的影響。結(jié)果證實，過表達M6P/IGF2R可以促進PEDV吸附細胞，干擾M6P/IGF2R?？梢越档蚉EDV的細胞吸附，這一結(jié)果與Díaz-Salinasa等[20]研究輪狀病毒的感染結(jié)果一致，所有經(jīng)轉(zhuǎn)染M6P/IGF2R siRNA的細胞中，病毒的傳染性均顯著降低30%～60%。由此提示，M6P/IGF2R在PEDV侵入細胞過程中可能起著細胞受體的作用。

綜上，本試驗通過VOPBA和質(zhì)譜分析篩選到M6P/IGF2R，激光共聚焦結(jié)果顯示其與PEDV存在共定位現(xiàn)象；通過過表達和干擾M6P/IGF2R后檢測病毒吸附結(jié)果證實，M6P/IGF2R能夠促進PEDV的吸附。本研究為進一步研究PEDV的受體提供理論參考。