魯文賡，劉慶，徐鄭美，原冬偉，李維龍，毛瑩瑩，馮琳，杜珍珍，曹立明，司琳清，金吉東，劉麗麗,付世新，韓英浩*

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319；3.科菲特飼料(長春)有限公司，吉林 長春 130012；4.四川省水產(chǎn)學校，四川 成都 401520)

近幾年，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生了翻天覆地的變化，資本的融入推動規(guī)?；?、集約化、現(xiàn)代化養(yǎng)殖在奶牛養(yǎng)殖模式中所占比重的迅速提升，使奶業(yè)的發(fā)展進入了一個全新的時期。在短時間內大幅提升規(guī)?；?、集約化、現(xiàn)代化養(yǎng)殖水平雖卓有成效，但一些棘手的疾病依舊限制著我國奶業(yè)的振興和奶業(yè)的健康快速發(fā)展。奶牛的肢蹄病是奶牛生產(chǎn)中的常見病、多發(fā)病，其與乳腺疾病、繁殖障礙性疾病、前胃疾病并稱為危害奶牛養(yǎng)殖的四大疾病[1]。蹄葉炎(laminitis)是在奶牛肢蹄病中所占比例最高的疾病，可達41%，同時72%的奶牛至少有一個蹄曾發(fā)生過蹄葉炎[2]。蹄葉炎的高發(fā)病率給牧場的治療與經(jīng)營費用上造成了高額經(jīng)濟負擔[3]。據(jù)報道，在美國因蹄葉炎給牧場所造成的直接和間接的經(jīng)濟損失為平均每年每頭牛177.62美元[4]。而我國每年因肢蹄病被迫過早淘汰的奶牛占總淘汰數(shù)的15%～30%，給奶牛業(yè)造成了巨大數(shù)額的經(jīng)濟損失[5]。而現(xiàn)如今尚未有一種能夠有效防治奶牛蹄葉炎，避免或減少牧場經(jīng)濟損失的方法，因而成為奶牛養(yǎng)殖場最為棘手的疾病之一。鑒于此，對奶牛蹄葉炎的防治研究已成為一個亟待解決的問題，尤其是將基礎理論研究成果轉化成臨床治療應用上。

脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)具有來源廣泛、采集方便、體外易于擴增、低免疫原性等特性，是目前再生醫(yī)學、組織工程、基因治療等方面比較理想的種子細胞[6-7]。AD-MSCs在特定的環(huán)境中可以定向分化，從而達到修復細胞和組織損傷的作用[8-9]。有研究表明，除了干細胞本身的分化作用外，其旁分泌所產(chǎn)生的細胞因子和外泌體在調節(jié)免疫反應與組織修復過程中發(fā)揮了更大的作用[10-12]。目前干細胞療法在人類與犬貓疾病的治療方面達到了超乎預期的效果[13]。而在大動物中，尤其是奶牛方面鮮有報道。因此，本試驗探討了牛脂肪間充質干細胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells，bAD-MSCs)制劑對奶牛蹄葉炎的臨床療效，為探索新的、有效的、綠色的治療奶牛蹄葉炎方法提供了新思路和臨床應用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

昆明系小鼠，雄性36只，體重30～40 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，合格證號為SCXK(遼)2015-0001。新西蘭白兔雄性3只體重2.1～2.5 kg，由長春生物制品研究所有限責任公司提供，合格證號為SCXK(吉)2013-0002。荷斯坦奶牛雌性12頭，由黑龍江省北安市某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場提供。

1.2 細胞和主要試劑

原代bAD-MSCs由本實驗室保存。DMEM(Gibco公司，美國)，F(xiàn)BS(四季青公司，中國)，胰蛋白酶(Solarbio公司，中國)，蘇木精(上海蘭秀貿易有限公司，中國)，伊紅(天津大茂化學公司)。

1.3 bAD-MSCs制劑制備

將原代bAD-MSCs進行復蘇，用10 cm培養(yǎng)皿進行傳代，1個10 cm培養(yǎng)皿中細胞計數(shù)為3.3×106個細胞，收集4個培養(yǎng)皿上的細胞，溶于30 mL滅菌生理鹽水中進行超聲破碎，隨后離心取上清用濾膜過濾，測量其蛋白質濃度，記為A液。收集4個培養(yǎng)皿中的上清液，透析除鹽，濾膜過濾后進行凍干，凍干粉溶于8 mL滅菌生理鹽水中，記為B液。將A液與B液按照3∶1的比例進行混合，制備成200 μg/mL的bAD-MSCs制劑。按照上述方法改變A液滅菌生理鹽水濃度，制備成不同濃度(400 μg/mL，800 μg/mL)的制劑。

1.4 小鼠毒性試驗

小鼠分為4組，分別為對照組(0.9% NaCl溶液)、低劑量組(200 μg/mL bAD-MSCs制劑)、中劑量組(400 μg/mL bAD-MSCs制劑)、高劑量組(800 μg/mL bAD-MSCs制劑)，每組各9只，分別于腹腔注射0.1 mL，注射劑量為臨床試驗的100倍以上。注射制劑后每日早晚兩次觀察各組小鼠的食欲，排糞，精神狀態(tài)等臨床癥狀。在其第0、1、3、7及14天，進行稱重，記錄體重變化，評價bAD-MSCs制劑對小鼠正常飼喂的影響。小鼠注射制劑后14 d時將各組小鼠進行最后1次稱重。隨后經(jīng)頸椎脫臼致死，剖開腹腔與胸腔取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行稱重。臟器系數(shù)按下列公式計算。臟器系數(shù)(%)=(臟器重量/體重)×100%。臟器稱重后用10%福爾馬林溶液固定，制作石蠟組織切片，經(jīng)HE染色。最后在顯微鏡下觀察其病理狀態(tài)。

1.5 熱原檢查方法

按照《中國藥典》三部(2015版)中的“熱原檢查法”進行判定。當日使用的家兔，正常體溫在38.0 ℃～39.6 ℃的范圍內，且各兔間正常體溫之差不超過1.0 ℃。測定其正常體溫后15 min內，對3只家兔，采取緣靜脈注射2 mL bAD-MSCs(400 μg/mL)制劑，注射劑量為臨床試驗的100倍以上。然后每隔30 min按前法測量其體溫1次，共測6次，以6次中最高的1次溫度減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度(℃)。

1.6 奶牛臨床試驗方法

根據(jù)宋寶強的奶牛蹄葉炎診治方法，經(jīng)牧場獸醫(yī)在擠奶大廳對奶牛進行臨床檢查，將蹄部腫大潮紅、患病蹄變形、站立時表現(xiàn)拱背、抵抗抬蹄檢查、蹄底與白線界限明顯、蹄底真皮層充血等癥狀的奶牛耳標號記錄[14]。當奶牛回到牛舍后按照之前記錄的耳標號，先遠觀其站立狀態(tài)，一般為前肢發(fā)病，后肢伸于腹下；后肢發(fā)病，前肢伸于腹下。后對其進行驅趕，其行走步態(tài)跛行嚴重，不愿走動喜臥。據(jù)此可確診奶?；加刑闳~炎。選取胎次平均為3次、其體況評分平均為2.5的泌乳中期蹄葉炎奶牛進行分組。分為對照組6頭(未治療)和治療組6頭。治療組經(jīng)蹄間叉上緣注射5 mL 400 μg/mL bAD-MSCs制劑。各組奶牛分別于即將注射之前(0 h)及注射制劑后第6、24、48 h，5、7、14天測量其體溫呼吸數(shù)，并由牧場同一獸醫(yī)對各組奶牛進行跛行評分等級盲評。跛行評分是評定奶牛正常行走能力的定性指數(shù)。評分值為1～5分，其中1分為正常；2分為輕度跛行；3分為中度跛行；4分為重度跛行；5分為嚴重跛行。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠毒性試驗

以3組不同劑量的bAD-MSCs制劑對小鼠進行腹腔注射。與對照組相比，試驗組小鼠精神狀態(tài)良好，食欲飲欲正常，試驗期間未見死亡。試驗組與對照組隨著時間變化的小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。試驗組組間比較未見統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠體重變化

臟器系數(shù)是反映動物器官健康的重要指標。研究結果顯示，低、中、制劑處理組與對照組的小鼠所有臟器系數(shù)相比，經(jīng)統(tǒng)計學分析，均無明顯差異(P>0.05)；試驗組組間相比所有臟器系數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計學分析無明顯差異(P>0.05)，見表1。解剖觀察各組小鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯臟器病變，經(jīng)HE染色的病理組織切片顯示，各組小鼠所有臟器無明顯病理學改變。

表1 bAD-MSCs制劑對小鼠臟器系數(shù)的影響

2.2 熱原檢查判定

經(jīng)家兔耳緣靜脈注射bAD-MSCs制劑進行熱原試驗。在受試的3只家兔中，體溫升高均低于0.6 ℃，且3只家兔體溫升高總和低于1.3 ℃。

2.3 患病奶牛臨床治療效果

利用bAD-MSCs制劑對患病奶牛進行治療。如表2所示，本研究所用奶牛的胎次與體況評分無顯著差異；試驗前與試驗后呼吸數(shù)和體溫變化也無顯著差異(P>0.05)。對同一患蹄葉炎的奶牛進行驅趕，治療前的狀態(tài)為行走時右后腿拖拽行走，蹄部只可輕微著地，不能完全受力，患病蹄腫大潮紅；治療后7 d時的治療效果為行走時步態(tài)正常，四肢受力均勻、步履矯健、更可起跳騰空(蹄部為受力點)，患病蹄可見其腫大面積減小和潮紅消退。試驗期間對照組奶牛跛行程度未見改善，且隨著時間的延長，跛行程度可見更加的嚴重。而在治療組在給藥6 h后其跛行程度開始逐漸變輕。在注射后48 h奶牛的跛行評分在治療組和對照組分別是3.25 ±0.25和4.5±0.29，治療效果明顯(P<0.05)；在注射后120 h奶牛的跛行評分在治療組和對照組分別是2.75±0.25和4.5±0.29 (P<0.01)，在注射后168 h兩組的跛行評分分別是 2.5±0.29和4.5±0.29(P<0.01)，其治療效果表現(xiàn)出顯著性差異；而在注射后336 h 奶牛的跛行評分在治療組和對照組分別是1.75±0.25和4.75±0.25，其治療效果表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.001)(圖2)。

表2 奶?；拘畔⒈?/p>

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖2 牛跛行評分變化

3 討論

奶牛蹄葉炎是一種無菌性炎癥，可誘發(fā)蹄白線病、蹄底潰瘍、蹄部變形等疾病，是引起奶牛跛行的主要原因[15]。關于蹄葉炎的誘發(fā)原因，學者們眾說紛紜，尚未有一定論。目前認為蹄葉炎的誘發(fā)原因主要包括亞急性瘤胃酸中毒、脂質代謝紊亂、牧場環(huán)境、年修蹄次數(shù)等[16-17]。但大家一致認可的是，蹄葉炎的發(fā)病原理為蹄部的炎癥反應、蹄真皮的血管破損、表皮細胞的異常分化[18]。針對其發(fā)病原理，牧場對蹄葉炎通常的治療方法可以簡單概括為：封閉療法、抗生素療法與保守療法。而這三種方法都存在著弊端，如封閉療法治標不治本，容易復發(fā)；抗生素療法存在抗生素濫用現(xiàn)象，影響動物食品安全；而保守療法見效慢，影響奶牛生產(chǎn)性能。因此，研發(fā)治療蹄葉炎的新方法，對我國奶業(yè)的振興和奶業(yè)的健康綠色發(fā)展具有重要意義。

在干細胞治療領域中，間充質干細胞(mesenchymal stem cells MSCs)應用于臨床的可能性已經(jīng)得到了證實。僅在2006—2012 年基于MSCs產(chǎn)品向美國食品和藥物管理局(FDA)提交的研究性新藥申請數(shù)量較之前增加了大約3倍[19]。干細胞療法不僅應用于人醫(yī)領域，在獸醫(yī)小動物方面也有大量的研究[20]，但尚未見到與奶牛相關的報道。因而本試驗將bAD-MSCs通過提純濃縮步驟，制作成不同蛋白濃度的制劑，首先進行了小鼠毒性與家兔熱原試驗。結果表明，bAD-MSCs制劑對小鼠的體重、主要臟器系數(shù)、臟器組織病理學均無影響，符合毒理學無毒性判定標準[21]。家兔熱原試驗的家兔體溫變化結果也與《中國藥典》三部(2015版)中“熱原檢查法”規(guī)定的無熱原性判定標準相一致[22]。研究表明bAD-MSCs制劑是無毒性、無熱原性和無刺激性的制劑。

在奶牛臨床治療試驗中，可以清晰地看出bAD-MSCs制劑有效地緩解奶牛病蹄的腫脹程度，顯著降低了患病牛跛行評分等級。利用人源AD-MSCs中純化的外泌體進行miRNA模擬試驗證明了miR-423-5p是外泌體中促血管生成的關鍵活性分子[23]。Vasilev等[24]在人源AD-MSCs對類風濕性關節(jié)炎的治療效果研究中闡明了AD-MSCs產(chǎn)生的分泌因子具有免疫調節(jié)作用。而Mitchel等[6]通過人源AD-MSCs的細胞外囊泡對光損傷的人真皮成纖維細胞的影響研究，闡明了AD-MSCs細胞外囊泡分泌的可溶性分子可以促進肌肉生成的機理。據(jù)此可以推論出本試驗所利用的bAD-MSCs制劑在治療奶牛蹄葉炎上所發(fā)揮出的較好療效，可能是bAD-MSCs中的分泌因子與外泌體修復了患病蹄內部破損血管并抑制了蹄部炎癥反應，從而減輕了臨床跛行的癥狀。

綜上所述，本試驗證實了bAD-MSCs制劑對奶牛蹄葉炎具有較好的療效，為探索治療奶牛蹄葉炎方法提供了新思路。至于bAD-MSCs制劑對于蹄葉炎治療的具體分子機制，尚需進一步深入探究。