廖書(shū)漪，徐立新，宋小凱，李祥瑞，嚴(yán)若峰，2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

旋毛蟲(chóng)病(Trichinosis)是由旋毛形線蟲(chóng)(Trichinellaspiralis)引起的一種食源性人獸共患病，對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)和人類(lèi)公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重危害[1]。該病在我國(guó)人群和動(dòng)物中廣泛流行，已在豬、犬、牛、羊、貓、鼠、狐貍、黃鼠狼、貂、貉、熊及麂等多種動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)該病，隨著飼養(yǎng)動(dòng)物及居民肉類(lèi)消費(fèi)量的增加，以及感染動(dòng)物種類(lèi)的增加，人的發(fā)病率不斷呈上升和擴(kuò)散趨勢(shì)[2-4]。我國(guó)旋毛蟲(chóng)病的防治工作任務(wù)艱巨，研究旋毛蟲(chóng)的免疫機(jī)理、發(fā)掘新的免疫保護(hù)性抗原，對(duì)防控該病具有重要意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲(chóng)二肽基肽酶1(dipeptidyl peptidase 1,Dpp1)在體外對(duì)大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖、遷移、一氧化氮分泌和吞噬功能等具有促進(jìn)作用[5]。但該蛋白是否具有免疫保護(hù)作用等尚不清楚。鑒于此，本研究在大鼠體內(nèi)開(kāi)展了Dpp1的免疫保護(hù)試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與蟲(chóng)株

Wistar大鼠、SD大鼠和BALB/c小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)株為中國(guó)河南豬分離株，國(guó)際編號(hào)為ISS534，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存于BALB/c小鼠體內(nèi)。

1.2 菌種和重組蛋白

重組菌株BL21/pET-32a和BL21/pET-32a-Dpp1由本實(shí)驗(yàn)室保存。pET-32a空載體蛋白和rDpp1重組蛋白的表達(dá)和純化方法均參考文獻(xiàn)[5]。

1.3 主要試劑

大鼠IL-4、IL-9、IL-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和IFN-γ的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京金益柏生物有限公司。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、IgG1、和IgG2a抗體為Abcam公司產(chǎn)品。RPMI細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.4 rDpp1對(duì)大鼠分泌細(xì)胞因子的影響

將50只標(biāo)準(zhǔn)體重的SD大鼠隨機(jī)分成5組(n=10)。第1組腹腔注射PBS，第2組腹腔注射160 μg pET-32a空載體蛋白，第3～5組分別腹腔注射10、40和160 μg重組蛋白rDpp1，每組每只大鼠注射體積均為1 mL。于注射前(第0天)，注射后第1、2、3、4、5和6天采集血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-4、IL-9、IL-17、TGF-β和IFN-γ等細(xì)胞因子的變化。

1.5 rDpp1抗體的制備

將200 μg重組rDpp1蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后，對(duì)Wistar大鼠背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行第1次免疫。2周后將與第1次免疫同等體積的重組蛋白混合弗氏不完全佐劑乳化后，進(jìn)行第2次免疫。之后，每隔1周進(jìn)行第3次和第4次免疫。第4次免疫1周后，眼眶采血，分離血清并分裝，-20 ℃凍存。

1.6 rDpp1抗體對(duì)旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)感染能力的抑制作用

將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組(n=10)，分別為PBS組、陰性血清組和抗rDpp1血清組。在細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔板選其中3孔)每孔加入8 000條旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)，再分別加入500 μL的PBS、陰性血清以及抗rDpp1血清，用含20%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液補(bǔ)至2 mL，37 ℃孵育2 h。檢查蟲(chóng)體活力，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，每只小鼠經(jīng)口感染500條肌肉幼蟲(chóng)。小鼠感染5 d后，取小腸，收集成蟲(chóng)并計(jì)數(shù)。

1.7 rDpp1的免疫程序與攻蟲(chóng)

將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組(n=20)，分別命名為rDpp1、pET-32a和PBS組。采用背部皮下多點(diǎn)注射方法進(jìn)行免疫，于第0天用弗氏完全佐劑乳化蛋白(40 μg rDpp1或pET-32a空載體蛋白)或PBS進(jìn)行第1次免疫，第14天用弗氏不完全佐劑乳化蛋白或PBS進(jìn)行第2次免疫。于第28天對(duì)每只小鼠灌胃感染肌肉幼蟲(chóng)400條。

1.8 抗rDpp1抗體的檢測(cè)

分別于免疫后第0、7、14、21和28天，從小鼠眼眶后靜脈叢采血，收集血清，用ELISA方法檢測(cè)抗rDpp1特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。

1.9 成蟲(chóng)和肌肉幼蟲(chóng)荷蟲(chóng)數(shù)分析

于第33天(人工感染5 d后)，每組隨機(jī)選取10只小鼠，取小腸，分離旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)并計(jì)數(shù)。于第63天(人工感染35 d后)，取每組剩下的10只小鼠、撲殺，分離肌肉組織、稱(chēng)重、剪碎、消化，計(jì)算每克肌肉中旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)的數(shù)量。具體方法參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果

2.1 rDpp1對(duì)大鼠分泌細(xì)胞因子的影響

腹腔注射重組蛋白rDpp1后，大鼠體內(nèi)IFN-γ的分泌水平顯著高于PBS空白對(duì)照組與pET-32a空載體蛋白對(duì)照組(圖1A)；IL-17的分泌在第2、3天顯著低于PBS空白對(duì)照組與pET-32a空載體蛋白對(duì)照組(圖1B)。而與對(duì)照組相比，IL-4(圖1C)、IL-9(圖1D)和TGF-β(圖1D)的分泌水平無(wú)顯著變化。

2.2 抗rDpp1抗體對(duì)旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)感染能力具有抑制作用

將抗rDpp1抗體與旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)共孵育后感染小鼠，對(duì)腸道成蟲(chóng)數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，PBS對(duì)照組旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)數(shù)為(438±116)個(gè)，陰性血清組為(423±54)個(gè)，抗rDpp1血清組為(266±50)個(gè)。抗rDpp1血清組成蟲(chóng)數(shù)量顯著低于PBS組(P<0.05)，成蟲(chóng)減少率為39.27%。陰性血清組和PBS對(duì)照組間差異不顯著。

注：與PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01；***P<0.001。下同A.IFN-γ；B.IL-17；C.IL-4；D.IL-9；E.TGF-β圖1 rDpp1對(duì)大鼠細(xì)胞因子分泌的影響

圖2 抗rDpp1抗體對(duì)旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)感染能力的影響

2.3 rDpp1免疫后宿主抗體水平的變化

抗rDpp1特異性IgG、IgG1亞型和IgG2a亞型抗體的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，第一次免疫7天后，rDpp1重組蛋白免疫組IgG水平顯著高于PBS和pET-32a組(P<0.05)，且PBS空白對(duì)照組和pET-32a空載體蛋白組之間差異不顯著(P>0.05)。第二次免疫后7天與14天(第21、28天)，rDpp1組抗體水平持續(xù)升高，與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.001)。

A.IgG;B.IgG1;C.IgG2a圖3 小鼠血清特異性抗體的變化

2.4 成蟲(chóng)和肌肉幼蟲(chóng)荷蟲(chóng)量的變化

腸道成蟲(chóng)計(jì)數(shù)結(jié)果如圖4A所示，PBS空白對(duì)照組旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)數(shù)為(109±23)個(gè)，pET-32a組為(89±32)個(gè)，rDpp1重組蛋白免疫組為(57±20)個(gè)。rDpp1免疫組成蟲(chóng)數(shù)量顯著低于PBS組(P<0.01)，成蟲(chóng)荷蟲(chóng)量減少47.70%。pET-32a組和PBS空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

肌肉幼蟲(chóng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4B所示，PBS組每克肌肉中旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)數(shù)量為(3 393±560)個(gè)，pET-32a組為(2 871±616)個(gè)，rDpp1重組蛋白免疫組為(1 203±125)個(gè)。rDpp1免疫組肌肉幼蟲(chóng)數(shù)量顯著低于PBS組(P<0.001)，減蟲(chóng)率為64.54%。pET-32a組和PBS組差異不顯著(P>0.05)。

圖4 旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)(A)和肌肉幼蟲(chóng)(B)荷蟲(chóng)數(shù)

3 討論

近年來(lái)，旋毛蟲(chóng)病研究在流行病學(xué)、診斷、病原生物學(xué)等方面取得了重要進(jìn)展[7-14]，特別是旋毛蟲(chóng)基因組計(jì)劃的實(shí)施和基因草圖的完成[15]，為其分子生物學(xué)和免疫學(xué)等研究提供了重要支持。然而，目前仍然沒(méi)有商品化的疫苗用于該病的預(yù)防。深入研究旋毛蟲(chóng)與宿主間相互作用，尤其是蟲(chóng)體對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)發(fā)掘新型疫苗候選抗原具有重要意義。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)二肽基肽酶1對(duì)宿主外周血單個(gè)核細(xì)胞的免疫功能具有顯著的刺激作用，是潛在的免疫保護(hù)性抗原[5]，本研究通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組Dpp1免疫小鼠后，成蟲(chóng)和肌肉幼蟲(chóng)分別減少了47.7%和64.5%，產(chǎn)生了較好的免疫保護(hù)效果。

在抗寄生蟲(chóng)感染過(guò)程中，Th1和Th2型免疫反應(yīng)及相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)揮著重要作用[16]。旋毛蟲(chóng)在腸道寄生階段，開(kāi)始主要以Th1型免疫應(yīng)答為主，之后以Th2型為主；在肌肉寄生階段則以Th2型免疫反應(yīng)為主，并在肌肉組織附近誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(Treg)[17]。這些研究結(jié)果提示旋毛蟲(chóng)具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的能力[18]。本研究檢測(cè)分別代表Th1、Th2、Th9、Th17和Treg等亞型免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-9、IL-17和TGF-β，探究rDpp1蛋白對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射rDpp1后大鼠體內(nèi)IFN-γ的分泌水平顯著高于對(duì)照組，推測(cè)該重組蛋白能夠引起宿主Th1型免疫反應(yīng)，這與Picherot等[19]認(rèn)為旋毛蟲(chóng)入侵機(jī)體后主要引起Th1型免疫應(yīng)答相一致。

由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫所產(chǎn)生的特異性IgG抗體，在抗旋毛蟲(chóng)感染中同樣發(fā)揮重要作用[20]。本研究通過(guò)體外抗體阻斷試驗(yàn)也直接證明了抗體的抗感染作用。旋毛蟲(chóng)感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG，該類(lèi)抗體也是免疫學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查的重要指標(biāo)[21]。研究表明中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞對(duì)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的殺傷作用主要依賴(lài)IgG，通過(guò)與IgG類(lèi)抗體結(jié)合發(fā)揮ADCC效應(yīng)[22-23]。IgGl亞型抗體主要反映Th2型免疫應(yīng)答，而IgG2a亞型抗體水平反映Th1型免疫應(yīng)答[20]。本研究結(jié)果顯示，佐劑乳化的rDpp1重組蛋白免疫小鼠后能引起特異性IgG抗體產(chǎn)生，為混合型Th1/Th2免疫應(yīng)答。

綜上，本研究證實(shí)旋毛蟲(chóng)rDpp1具有較好的免疫保護(hù)作用。研究結(jié)果為深入調(diào)查Dpp1功能奠定基礎(chǔ)。