謝佳芮，寇美玲，陳培富，苗海生*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

脫離于動(dòng)物本體培養(yǎng)的傳代細(xì)胞，由于沒有體液調(diào)節(jié)和免疫系統(tǒng)的參與，失去了動(dòng)態(tài)平衡，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞本身就會(huì)發(fā)生變化[1]。人工細(xì)胞培養(yǎng)，由于受到化學(xué)、物理或生物因素等的影響，例如：血清質(zhì)量問題、微生物污染、培養(yǎng)條件等，使得細(xì)胞發(fā)生自發(fā)的轉(zhuǎn)化，核型發(fā)生改變，并且這種遺傳特征的變化也會(huì)隨著細(xì)胞分裂傳遞給子代細(xì)胞[1]。因此，細(xì)胞系在傳統(tǒng)的應(yīng)用中存在不少問題，導(dǎo)致其對(duì)病毒的易感性發(fā)生變化；同時(shí)，動(dòng)物病毒在新的環(huán)境下不斷發(fā)生變化，對(duì)細(xì)胞系的易感性下降等造成了培養(yǎng)難度大、病毒滴度低等問題[2]。國外有學(xué)者已經(jīng)篩選出豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)高感染率的細(xì)胞株P(guān)K15-C1、PKKC細(xì)胞。在研究中發(fā)現(xiàn)PK15細(xì)胞對(duì)PCV2的易感性呈多樣化的，包含高感染率和低感染率的細(xì)胞。通過單細(xì)胞克隆技術(shù)，可以從PK15母細(xì)胞中挑選高感染率的PK15細(xì)胞[3]。鑒于上述實(shí)例，通過科學(xué)的方法來提高病毒對(duì)細(xì)胞的感染水平，可有效提高細(xì)胞中病毒的增殖效率[4-5]。因此，要獲得性狀穩(wěn)定，生長狀態(tài)一致的單一細(xì)胞株，即可將細(xì)胞純化培養(yǎng)最后得到適應(yīng)于病毒增殖的高產(chǎn)細(xì)胞株[6]。

目前，關(guān)于細(xì)胞系進(jìn)行有限稀釋和細(xì)胞克隆的報(bào)道較多，如對(duì)PCV2高度易感的PK-15細(xì)胞系[7-11]，對(duì)日本腦炎病毒高度易感的BHK系[12]，對(duì)流行性出血熱病毒易感的Vero-E6純化細(xì)胞系[1,6]，適應(yīng)于流感病毒培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞株和Vero細(xì)胞株的克隆[13-15]，對(duì)豬瘟病毒高度易感的ST細(xì)胞系和PK15細(xì)胞系[16-17]，對(duì)豬細(xì)小病毒易感的ST-5細(xì)胞系的克隆[18],對(duì)牛病毒性腹瀉/黏膜病毒易感MDBK細(xì)胞克隆[19]等。

課題組用Marc-145細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后，在細(xì)胞上不出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，提取核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增PRRSV基因組，電泳后核酸濃度很低。在排除了支原體、霉菌和酵母菌等污染[20]，以及其他病毒感染后，觀察Marc-145細(xì)胞發(fā)現(xiàn)大小不一、形態(tài)不一致、不均勻的現(xiàn)象，同時(shí)使用實(shí)驗(yàn)室保存的其他Marc-145細(xì)胞對(duì)PRRSV進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)增殖能力不如初始Marc-145細(xì)胞株，重新引種和復(fù)蘇低代次細(xì)胞效果都無法保證，最后嘗試采用單細(xì)胞克隆的方法，篩選獲得了能穩(wěn)定傳代、對(duì)PRRSV易感且病毒滴度高的細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 材料

Marc-145細(xì)胞，湖北農(nóng)科院引入，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)保存。PRRSV毒株(YNSN2014)由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到。DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司；新生牛血清,購自金源康公司；胰酶，購自JHR公司。核酸提取試劑盒，購自 Invitrogen 公司；RT-PCR相關(guān)試劑，購自TaKaRa公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 單細(xì)胞克隆

處于對(duì)數(shù)生長期Marc-145細(xì)胞按照一定的試劑用量消化吹散，然后測定該細(xì)胞每毫升的細(xì)胞密度，將測算好細(xì)胞密度的懸液稀釋成<1個(gè)/100 μL的濃度，加入2塊96孔板內(nèi)，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，出現(xiàn)細(xì)胞小群落時(shí)，根據(jù)情況更換板內(nèi)的生長液。多次重復(fù)以上步驟，并在倒置顯微鏡下觀察記錄只有一個(gè)細(xì)胞的孔，當(dāng)孔中細(xì)胞密集時(shí)，將具有代表性的孔進(jìn)行標(biāo)記，然后陸續(xù)將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，此時(shí)可獲得Marc-145細(xì)胞的單細(xì)胞克隆株。

1.3 RT-PCR的檢測

PRRSV的高度特異性保守區(qū)域?yàn)镺RF7基因序列，參照左奕等[21]建立的PRRSV RT-PCR檢測方法。其中上游引物序列為：5′-CAAATAACAACGGCAAGCAG-3′,下游引物序列為：5′-GCGTAGGCAAACTAAACTCCA -3′，擴(kuò)增片段長度約321 bp，引物由碩擎生物技術(shù)有限公司合成。加入2×one step PCR Buffer(with Mg2+)12 μL，RE Mix 1 μL，上游引物(10 μm/μL)1 μL，下游引物(10 μm/μL)1 μL，RNase-free H2O 8 μL，RNA模板2 μL，總量25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃，30 min；94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s，共28個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)體系，12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 病毒核酸的定量 PCR 比較

在12孔板中培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞克隆株和原始細(xì)胞株，每株細(xì)胞設(shè)2個(gè)重復(fù)孔，1孔接毒、1孔為空白對(duì)照，接種相同劑量的病毒液后培養(yǎng)72 h,反復(fù)凍融3次，收集病毒液。提取樣品 RNA，測其RNA質(zhì)量濃度，之后進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，該試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.5 測定PRRSV在各克隆株上的增殖情況

克隆的細(xì)胞株制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為 1×105個(gè)/100 μL。PRRSV用 DMEM 全生長液稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，共7個(gè)稀釋度。將7個(gè)稀釋度的含毒液接到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種50 μL 病毒液，將細(xì)胞懸液分別加到上述96孔板內(nèi)，每個(gè)孔接種100 μL 細(xì)胞懸液。做好標(biāo)記，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，72 h后觀察CPE現(xiàn)象，試驗(yàn)平行重復(fù)3次，根據(jù)Reed-Muench法[6]，計(jì)算TCID50值，最后得出TCID50平均值。

為得到準(zhǔn)確的TCID50檢測結(jié)果，96孔板每孔加入30μL 2%甲基藍(lán)染液，反應(yīng)作用30 min，沖洗干凈，晾干后觀察。

1.6 Marc-145細(xì)胞各克隆株生長曲線繪制

將篩選到的Marc-145細(xì)胞克隆株每5代凍存一次，傳到第60代，對(duì)第5，10，20，30，40，50，60代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)及生長情況觀察，到第60代時(shí)，取細(xì)胞1×105/mL，傳到6孔板內(nèi)，于0，4，8，12，24，36及48 h分別用胰酶消化細(xì)胞孔，然后置于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀下，測定細(xì)胞密度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞克隆

經(jīng)過21 d培養(yǎng)，96板孔內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞小集落，且細(xì)胞有不同形態(tài)。倒置顯微鏡觀察，選出細(xì)胞克隆株2-D4、2-E6、2-C8、2-G9、2-H11(在第2塊96孔板內(nèi)，分別位于D行第4列、E行第6列、C行第8列、G行第9列、H行第11列)。每個(gè)細(xì)胞株形態(tài)一致,大小均等，未見異常細(xì)胞和不均一的細(xì)胞，見圖1。

A.2-D4；B.2-E6；C.2-C8；D.2-G9；E.2-H11圖1 5株克隆細(xì)胞(1 000×)

2.2 PRRSV在各克隆株上的增殖情況

PRRSV接毒72 h后2-D4、2-E6、2-C8和2-H11株細(xì)胞上出現(xiàn)肉眼可見的CPE，發(fā)生細(xì)胞破碎、聚集、皺縮變圓、折光性改變、最后脫落。原始細(xì)胞和2-G9克隆株未出現(xiàn)細(xì)胞病變。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-D4、2-E6、2-C8和2-H11細(xì)胞培養(yǎng)均可檢測到清晰的目的條帶，而2-G9和原始細(xì)胞培養(yǎng)物RT-PCR擴(kuò)增物條帶較為模糊(圖2)。

2.3 單克隆細(xì)胞病毒滴度檢測

原始株和2-G9克隆株未有明顯CPE，故無法計(jì)算TCID50值。針對(duì)觀察結(jié)果，就出現(xiàn)CPE的2-D4，2-E6，2-C8，2-H11株克隆株計(jì)算TCID50值。根據(jù)Reed-Muench法，其中，2-D4克隆株TCID50平均值為106.625TCID50/mL，2-E6為105.125TCID50/mL，2-C8為104.17TCID50/mL，2-H11為105.875TCID50/mL，TCID50值測定情況表明，2-D4株克隆株對(duì)PRRSV病毒易感性和適應(yīng)性較其他幾株克隆株較高，見表1。

M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.2-D4克隆株；2.2-D4克隆株對(duì)照；3.2-E6克隆株；4.2-E6克隆株對(duì)照；5.2-C8克隆株；6.2-C8克隆株對(duì)照；7.2-G9克隆株；8.2-G9克隆株對(duì)照；9.2-H11克隆株；10.2-H11克隆株對(duì)照；11.原始Marc-145；12.原始Marc-145對(duì)照；13.病毒原液對(duì)照?qǐng)D2 Marc-145細(xì)胞接毒72 h后RT-PCR檢測結(jié)果

表1 4株單克隆細(xì)胞病毒滴度檢測結(jié)果

2.4 Marc-145細(xì)胞可用克隆株及原始株生長情況

通過對(duì)Marc-145細(xì)胞4個(gè)克隆株和Marc-145親代細(xì)胞不間斷培養(yǎng)至60代后，觀察細(xì)胞的生長情況和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，2-D4株生長狀態(tài)較好且生長速度明顯快于其他幾株克隆株，Marc-145克隆株細(xì)胞的增殖計(jì)數(shù)結(jié)果見表2。

表2 5個(gè)細(xì)胞株的增殖計(jì)數(shù) 個(gè)/mL

將上述試驗(yàn)結(jié)果匯總于表3，對(duì)比各項(xiàng)指標(biāo)，通過單細(xì)胞克隆技術(shù)，從原始親代Marc-145細(xì)胞中成功克隆出5株細(xì)胞，通過檢測PRRSV在這5株細(xì)胞上的增殖情況，測定TCID50值，評(píng)判細(xì)胞生長情況。根據(jù)這些指標(biāo)，綜合判定2-D4株最適宜用于對(duì)PRRSV的培養(yǎng)。

表3 5個(gè)克隆株的篩選

3 討論

目前實(shí)驗(yàn)室從病料中分離PRRSV主要使用Marc-145細(xì)胞。據(jù)研究報(bào)告，PRRSV在外界環(huán)境中不穩(wěn)定，對(duì)濕度、pH以及溫度變化敏感；在常溫的外界環(huán)境中存活時(shí)間不長，極端環(huán)境可以使病毒對(duì)細(xì)胞的感染力迅速喪失[22]。因此，對(duì)PRRSV的分離就需要易感的細(xì)胞株。

有研究報(bào)道，PRRSV感染處于G2/M期的細(xì)胞上清中的病毒滴度最高，病毒含量最多；G0/G1期次之；S期病毒含量最低[23-25]。這表明病毒在Marc-145細(xì)胞的G2/M期增殖較快，而處于S期的Marc-145細(xì)胞較不利于PRRSV增殖。在不同的細(xì)胞周期內(nèi)，PRRSV的細(xì)胞受體表達(dá)水平不同。在Marc-145細(xì)胞的G0/G1期內(nèi) CD163 表達(dá)水平最高，G2/M 期表達(dá)水平次之，S期的表達(dá)量最低[23]。因此，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞群中不同細(xì)胞周期細(xì)胞混雜，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生化特性存在明顯差異，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)也不均一，從而導(dǎo)致病毒細(xì)胞受體的表達(dá)與其功能的發(fā)揮也不一致，致使病毒對(duì)不同周期細(xì)胞感染產(chǎn)生差異[24-25]。

常規(guī)的有限稀釋法操作缺點(diǎn)是人為操作誤差大，無法科學(xué)精準(zhǔn)地保證每個(gè)孔只有一個(gè)細(xì)胞。因此，本試驗(yàn)將細(xì)胞懸液的密度稀釋到<10個(gè)/mL，最大化地保證每個(gè)孔只有一個(gè)細(xì)胞的樣本盡可能的多，確保最后得到的克隆株是純化后的單一克隆。為了培育對(duì)PRRSV易感的Marc-145細(xì)胞，以2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選育：一是在形態(tài)上選擇生長旺盛、大小均等、形態(tài)均一、邊緣清晰的Marc-145細(xì)胞，通過連續(xù)培養(yǎng)不出現(xiàn)細(xì)胞脫落、崩解、碎裂以及空泡化現(xiàn)象；二是細(xì)胞上的病毒滴度能大幅度提升。本研究結(jié)果顯示，最終選育成功的2-D4克隆株符合上述選育標(biāo)準(zhǔn)，且該株細(xì)胞現(xiàn)已傳代至70代，至于該細(xì)胞株能否無限傳代下去并保持現(xiàn)有的細(xì)胞特性，有待進(jìn)一步的研究。