江嘉玲，張 芹，胡 艷，黃 婧，宋見春，盧占軍,2,?

(1.贛南師范大學 生命科學學院；2.國家臍橙工程技術研究中心，江西 贛州 341000)

鐵是生命活動過程中的重要元素，作為輔因子，廣泛參與DNA的合成，氧代謝、三羧酸循環(huán)、激素以及氨基酸的合成等過程[1-2].然而，鐵過量也會對細胞產(chǎn)生毒性[3].因此，保持生物體內(nèi)鐵離子的平衡至關重要.在生物體中，90%以上的鐵都與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，這些含鐵蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能，主要包括運輸鐵離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)和儲存鐵離子的鐵蛋白(Ferritin).

鐵蛋白是普遍存在于生物界的一種高度保守的多功能蛋白，其廣泛分布于動物、植物和微生物中，由重鏈同源亞基(heavy chain homology，HCH)和輕鏈同源亞基(light chain homology，LCH)組成的分子量約為400-600 kDa的球形蛋白，而這些亞基組成4, 3, 2點對稱或八面體對稱的空心球體，空腔內(nèi)可以容納4500個鐵原子[4-5].然而，機體中的鐵蛋白重鏈亞基和輕鏈亞基的功能并不一樣，重鏈亞基主要參與鐵離子的快速解毒，而輕鏈亞基在鐵離子的成核、礦化以及長期儲存過程中起著關鍵作用[6].近年來，昆蟲鐵蛋白的功能一直是研究的熱點.晶體結(jié)構分析揭示昆蟲鐵蛋白由12個HCH和12個LCH組成的四面體對稱結(jié)構，與哺乳動物鐵蛋白復合體形成的八面體對稱結(jié)構類似[4].Dunkov等人從家蠶基因組中鑒定3個與鐵蛋白相關的蛋白：Fer1HCH，F(xiàn)er2LCH和Fer3HCH，家蠶鐵蛋白的重鏈亞基與大部分昆蟲鐵蛋白都具有高度保守的鐵氧化酶活性中心[7].Georgeva等人采用RNA印跡法對果蠅(Drosophilamelanogaster)鐵蛋白重鏈亞基進行了研究，結(jié)果顯示存在三個雜交條帶，推測可能是由于可變剪切產(chǎn)生[8].在東方果實蠅(Bactroceradorsalis)中，輕鏈亞基受轉(zhuǎn)錄后以及可變剪切機制共同調(diào)控，最終導致提前產(chǎn)生終止密碼[9].此外，鐵蛋白也從一些魚類和貝類等海洋生物中被鑒定，包括鮑魚(Haliotisdiversicolor)，刺參(Stichopusmonotuberculatus)以及扇貝(Chlamysfarreri)[10-11].

鐵作為重要的金屬離子參與宿主許多重要的生理過程，同時也是病原菌入侵的營養(yǎng)來源.因此，鐵在免疫過程中也發(fā)揮著重要作用.宿主一旦感染病原菌，生物體中的鐵蛋白含量將發(fā)生顯著性的變化.例如甲蟲(Protaetiabrevitarsis)感染白僵菌(Beauveriabassiana)后，血液中的鐵含量明顯增加[12].在綠棉鈴蟲(Heliothisvirescens)病毒刺激以后，血液中的鐵含量也增加[13].這些研究暗示了鐵含量的變化在病原菌與宿主之間互作關系中作為重要的指標.Boran等人利用抑制消減雜交分析赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)注射脂多糖后鐵蛋白主要參與免疫防御和信號傳導.同樣在蓖麻蠶(Samiacynthiaricini)中，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)能顯著的誘導鐵蛋白重鏈亞基基因上調(diào)表達[14].另一方面，過量的2價鐵能夠通過芬頓反應(Fenton reaction)被氧化為3價鐵，同時產(chǎn)生大量的羥基自由基，對細胞產(chǎn)生毒害作用，從而使蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化和DNA斷裂等[15].然而，有關玉帶鳳蝶(Papiliopolytes)鐵蛋白的功能還未見報道.

玉帶鳳蝶P.polytes屬于鱗翅目鳳蝶科，在我國廣為分布，其幼蟲是危害柑橘類植物的重要害蟲[16].當前，玉帶鳳蝶的防治主要依靠化學殺蟲劑，不僅污染環(huán)境，而且使害蟲的抗藥性明顯增強.因此，從害蟲本身出發(fā)，對關鍵基因的結(jié)構以及功能解析可以更好的防治害蟲[14].本研究從玉帶鳳蝶基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定到鐵蛋白的2個亞基基因：PpFerHCH和PpFerLCH，通過生物信息學和熒光定量PCR分析2個基因的組織表達譜以及鐵離子脅迫下的表達水平，為進一步研究玉帶鳳蝶鐵蛋白的功能奠定基礎，同時也對開發(fā)綠色新型生物殺蟲劑提供了新思路.

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與樣品收集

玉帶鳳蝶采集自贛南師范大學國家臍橙工程技術研究中心種質(zhì)資源圃內(nèi)，分別取玉帶鳳蝶5齡第1天幼蟲的頭部、中腸、血淋巴、表皮、馬氏管和脂肪體等組織.鐵離子脅迫材料的準備參考Fei等人的方法[17]，取5齡第1天的玉帶鳳蝶，經(jīng)口添食10 μL10% FeCl3溶液，對照組添食10 μL 0.85%NaCl溶液，24 h以后收集中腸組織，實驗分成3組，每組20頭，并用液氮迅速冷凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 主要試劑和儀器

DH5α大腸桿菌和pMD19-T克隆載體由本實驗室保存；Trizol試劑購自Invitrogen(北京)公司；膠回收試劑盒、PrimeScriptTM1st Strand cDNA synthesis Kit和SYBR Green Ⅱ購自TaKaRa(大連)公司；所用的引物通過Primer premier 5.0軟件設計，并由上海生物工程有限公司合成.NanoDrop 2000 spectrophotometer購自Thermo Fisher Scientific(上海)公司；LightCycle?96 PCR Detection System購自Roche(上海)公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 玉帶鳳蝶各組織總RNA提取及cDNA的合成

采用Trizol法提取玉帶鳳蝶各組織的總RNA，具體參考蓖麻蠶組織RNA提取方法[14].取100 mg組織加入液氮充分研磨成粉末，加入1 mL Trizol充分混勻，室溫靜置5 min；加入200 μL酸性酚，200 μL氯仿后振蕩混勻，室溫靜置3 min；后取上清液(重復該過程1次)；加入等體積的異丙醇混勻；室溫靜置10 min，4 ℃，12,000 g，離心15 min后去除上清液；加入1 mL 75%的乙醇(DEPC水配置)重懸沉淀，4 ℃，7 500 g，離心5 min，去除上清；室溫干燥8 min以去除多余的乙醇，然后加入適量的DEPC水充分溶解RNA，并通過紫外光分光光度計檢測RNA的濃度及純度.將總RNA使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒處理，并按照試劑盒說明書完成cDNA第一鏈的合成，以此作為PCR的模板.

1.3.2 玉帶鳳蝶鐵蛋白亞基PpFerHCH和PpFerLCH的鑒定

根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表的鱗翅目昆蟲鐵蛋白的重鏈亞基和輕鏈亞基的蛋白質(zhì)序列，包括家蠶(Bombyxmori)、煙草天蛾(Manducasexta)、大蠟螟(Galleriamellonella)和蓖麻蠶(Samiacynthiaricini)，通過BLASTX軟件對玉帶鳳蝶基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索，獲得2個包含完整開放閱讀框的鐵蛋白輕鏈亞基和重鏈亞基的序列，利用Primer premier 5.0軟件設計引物擴增2個基因的開放閱讀框并送至生物公司進行測序.

1.3.3 生物信息學分析

通過DNAMAN7.0軟件分析目的基因cDNA序列的開放閱讀框和氨基酸序列；序列同源性搜索使用BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；采用DNAMAN軟件對目的基因和其他昆蟲同源序列進行多重序列比對，利用Expasy在線軟件(https://web.expasy.org/compute_pi/)預測目標蛋白的理論分子量和等電點；利用MEGA5.2軟件的鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)對蛋白質(zhì)的結(jié)構域進行分析.

1.3.4 內(nèi)參基因的確立

通過搜索玉帶鳳蝶基因組數(shù)據(jù)庫，獲得了4個不同功能的內(nèi)參基因，即肌動蛋白A1(Actin-A1，登錄號：)、核糖體蛋白60(RP60，登錄號：)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，登錄號：)和E2F轉(zhuǎn)錄因子4(E2F4，登錄號：).根據(jù)核苷酸序列運用Primer Premier5.0軟件設計特異性表達引物(表1)，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行引物特異性比對.

表1 引物序列

1.3.5 基因的時空表達分析

取玉帶鳳蝶5齡第1天幼蟲的頭、中腸、血液、脂肪體、馬氏管和表皮，分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用熒光定量PCR和半定量PCR分析4個內(nèi)參基因在玉帶鳳蝶不同組織中的表達水平，確定合適的內(nèi)參基因.利用熒光定量PCR檢測2個基因在幼蟲不同組織和鐵離子脅迫后的表達水平.反應體系為SYBR 10 μL，ROX 0.4 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，用ddH2O補齊至20 μL.反應條件為：50 ℃預熱2 min；95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán).實驗用3次獨立樣品重復3次.反應均在ABI Prism 7500 Fast Detection System(Applied Biosytems)實時定量PCR 儀上完成.

2 結(jié)果分析

2.1 PpFerHCH和PpFerLCH開放閱讀框的克隆與分析

以玉帶鳳蝶中腸cDNA為模板，根據(jù)其設計的特異性引物，對PpFerHCH和PpFerLCH的開放閱讀框進行PCR擴增，分別得到636 bp和696 bp的特異性片段(圖1).通過序列比對，結(jié)果顯示PpFerHCH基因的cDNA全長為1300 bp，編碼211個氨基酸，預測的理論分子量為23.7 kDa，等電點為6.53.PpFerLCH基因的cDNA全長為1 207 bp，編碼231個氨基酸，預測的理論分子量為26.5 kDa，等電點為5.64.

圖1 玉帶鳳蝶PpFerHCH和PpFerLCH基因開放閱讀框的PCR擴增

SMART軟件分析顯示PpFerHCH和PpFerLCH都含有一個信號肽和一個保守的鐵蛋白結(jié)構域(圖2).多重序列比對分析顯示PpFerHCH和PpFerLCH與其他已知昆蟲鐵蛋白相似性非常高，氨基酸序列的一致性介于之間，并與煙草天蛾蛋白序列一致性最高，表明玉帶鳳蝶鐵蛋白亞基在物種間比較保守.

圖2 玉帶鳳蝶PpFerHCH和PpFerLCH基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列(雙下劃線表示鐵離子結(jié)合中心；方框表示預測的信號肽；單下劃線表示鐵蛋白結(jié)構域) 圖3 玉帶鳳蝶PpFerLCH及其同源基因推導的氨基酸序列的多序列比對結(jié)果

基于不同昆蟲鐵蛋白重鏈亞基和輕鏈亞基的氨基酸序列，對玉帶鳳蝶的鐵蛋白亞基進行了系統(tǒng)發(fā)育樹分析，如圖5所示，昆蟲的鐵蛋白重鏈亞基和輕鏈亞基分別聚類到一起，其中，玉帶鳳蝶鐵蛋白重鏈亞基(PpFerHCH)與煙草天蛾鐵蛋白重鏈亞基的親緣關系最近，而玉帶鳳蝶鐵蛋白輕鏈亞基(PpFerLCH)主要與煙草天蛾和大蠟螟保持較高的同源性.這些結(jié)果進一步反應出了鱗翅目昆蟲中鐵蛋白亞基的保守性.

圖4 玉帶鳳蝶PpFerHCH及其同源基因推導的氨基酸序列的多序列比對結(jié)果 圖5 玉帶鳳蝶PpFerHCH和PpFerLCH與其他昆蟲鐵蛋白亞基的系統(tǒng)進化樹枝上顯示bootstrap 1000個循環(huán)的置信度

2.2 內(nèi)參基因的特異性驗證

為了篩選5齡玉帶鳳蝶不同組織的最適內(nèi)參基因，通過半定量PCR和熒光定量PCR對4個篩選出的基因進行驗證，結(jié)果如圖6A所示，ActinA1和E2F4在不同組織中的表達水平顯示較大的波動性，而GAPDH和RP60在不同組織中的相對表達量比較穩(wěn)定.熒光定量PCR結(jié)果與半定量結(jié)果相一致，但是RP60的穩(wěn)定性要顯著高于GAPDH(圖6B).因此，GAPDH為5齡玉帶鳳蝶不同組織的最適內(nèi)參基因.

圖6 候選內(nèi)參基因在玉帶鳳蝶不同組織中的相對表達水平分析

2.3 PpFerHCH和PpFerLCH基因的組織表達譜

為了確定PpFerHCH和PpFerLCH基因在玉帶鳳蝶5齡第1天不同組織中的表達模式，利用熒光定量PCR對其在不同組織中的相對表達水平進行檢測，結(jié)果如圖7所示，PpFerHCH和PpFerLCH主要在玉帶鳳蝶的中腸和馬氏管中高表達，而在頭部和血淋巴的相對表達水平較低.

圖7 PpFerHCH和PpFerLCH基因在玉帶鳳蝶不同組織中的相對表達水平分析

2.4 PpFerHCH和PpFerLCH應答鐵離子刺激的表達水平分析

為了研究鐵過量刺激對玉帶鳳蝶鐵蛋白表達水平的影響，對5齡第1天的玉帶鳳蝶添食10% FeCl3，24 h后提取中腸組織RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用RT-qPCR分析PpFerHCH和PpFerLCH的表達水平.結(jié)果如圖8所示，添食FeCl324 h以后，與對照組相比，PpFerHCH和PpFerLCH的表達水平顯著上調(diào).

圖8 10% FeCl3刺激后PpFerHCH和PpFerLCH在中腸中的相對表達水平分析

3 討論

鐵是生命活動中的必須營養(yǎng)物質(zhì)，鐵蛋白是一種普遍存在的鐵結(jié)合蛋白，在鐵的儲存和運輸過程中扮演著重要角色.脊椎動物鐵蛋白由24個亞基構成的分子量約為440 kDa的異源多聚體，亞基的組成包括重鏈和輕鏈兩類，分別由不同基因編碼.在昆蟲中，鐵蛋白也是由2種類型的亞基構成，但是多聚體的分子量普遍比哺乳動物大[2].Dunkov等人揭示煙草天蛾的天然鐵蛋白的分子量超過669 kDa[18].在我們之前的研究中，通過蛋白質(zhì)電泳和質(zhì)譜技術分離了家蠶鐵蛋白，揭示分子量約為670 kDa[17].在本研究中，通過進化樹發(fā)現(xiàn)玉帶鳳蝶鐵蛋白重鏈亞基和輕鏈亞基都與煙草天蛾保持較高的同源性.因此，我們推測玉帶鳳蝶的天然鐵蛋白的分子量大約為669 kDa.在哺乳動物中，細胞外的鐵離子主要通過轉(zhuǎn)鐵蛋白運輸，細胞內(nèi)的鐵離子通過鐵蛋白儲存.與哺乳動物不同的是，昆蟲鐵蛋白大部分都屬于分泌性蛋白.在刺舌蠅(Glossinamorsitans)中，GmmFer1HCH和GmmFer2HCH都含有一個假定的信號肽[19].在熊蜂(Bombusignitus)中，BiFerHCH也包含一個假定的信號肽[20].我們發(fā)現(xiàn)玉帶鳳蝶鐵蛋白輕鏈亞基和重鏈亞基都含有一個假定的信號肽，進一步揭示玉帶鳳蝶鐵蛋白是一個分泌型蛋白.此外，PpFerHCH基因的5’UTR包含一個鐵反應元件(IRE)，該元件可以形成莖環(huán)結(jié)構，是鐵調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點，在調(diào)控鐵吸收與釋放代謝過程中起著重要作用.鐵反應原件是受到鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRP)的調(diào)節(jié).當細胞鐵缺乏時，IRP和IRE結(jié)合，阻止鐵蛋白表達，從而減少過載鐵，減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生[21-22].

熒光定量PCR技術已經(jīng)普遍用于基因表達的分析，而內(nèi)參基因的選擇顯著影響著實驗結(jié)果的準確性.任何一種內(nèi)參基因的所謂恒定表達都只是在一定類型的細胞或?qū)嶒炓蛩刈饔孟碌暮愣?，所以在選擇合適的內(nèi)參基因?qū)⒂行煌瑯颖驹赗NA的質(zhì)量、產(chǎn)量以及反轉(zhuǎn)錄效率方面的差異[23].目前，對于玉帶鳳蝶，內(nèi)參基因的選擇還沒報道，只有先確定合適的內(nèi)參基因，才能進一步確定目的基因在特定實驗條件下的表達.在以前的報道中，Teng等人對鱗翅目昆蟲內(nèi)參基因的選擇進行了研究，結(jié)果顯示，核糖體蛋白49(RP49)和三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)在家蠶和甜菜夜蛾的不同發(fā)育時期比較穩(wěn)定；GAPDH、RP49和E2F在家蠶、甜菜夜蛾和二化螟的不同組織中表達量比較穩(wěn)定[24].在本研究中，半定量PCR和熒光定量PCR分析顯示RP60在玉帶鳳蝶不同的組織中的表達量相對穩(wěn)定.因此，RP60可以作為玉帶鳳蝶的內(nèi)參基因.

通過RT-qPCR分析顯示，PpFerHCH和PpFerLCH基因主要在玉帶鳳蝶的中腸和馬氏管中高表達，其次是脂肪體.昆蟲中腸作為分泌消化酶和其他酶類的主要部位，起著消化食物和吸收養(yǎng)分的重要作用，同時也是病原微生物和各種毒素的作用靶標，因此，中腸在昆蟲的免疫過程中起著重要作用[25].玉帶鳳蝶鐵蛋白的2個亞基在中腸中高表達，也就暗示PpFerHCH和PpFerLCH在玉帶鳳蝶的免疫過程中起著關鍵作用.在東方果實蠅中，BdFer1HCH和BdFer2LCH也在中腸中高表達[9].有意思的是，我們也發(fā)現(xiàn)PpFerHCH和PpFerLCH在玉帶鳳蝶的馬氏管中具有較高的表達水平.昆蟲的馬氏管作為重要的排泄器官，維持機體內(nèi)的滲透壓、水份和無機鹽的平衡.研究發(fā)現(xiàn)在果蠅的馬氏管體內(nèi)大量表達了細胞色素P450、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙醇脫氫酶等酶類，暗示了果蠅馬氏管在異源物質(zhì)的代謝和解毒方面起了關鍵作用[26].Shireen-Anne等人研究發(fā)現(xiàn)在果蠅馬氏管內(nèi)存在一些抗菌肽的表達，主要包括Dipericin、Metchnikowin和Cecropin[27].這些研究結(jié)果表明馬氏管在昆蟲的免疫防御過程中起著關鍵作用.因此，我們推測PpFerHCH和PpFerLCH在玉帶鳳蝶的馬氏管中可能參與先天性免疫反應.與哺乳動物相比，大部分昆蟲鐵蛋白屬于分泌性蛋白，由脂肪體合成分泌到血淋巴中，再通過血淋巴循壞運送到機體的各個組織中發(fā)揮功能[28-29].PpFerHCH和PpFerLCH在玉帶鳳蝶脂肪體中也具有較高的表達水平，可能于鐵蛋白的合成有關，具體的機制還需要進一步研究.

之前的研究已經(jīng)表明鐵蛋白能夠有效地調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵代謝的平衡.在本研究中，10% FeCl3刺激24 h后，中腸中PpFerHCH和PpFerLCH的相對表達量顯著上升.因鐵蛋白是一種急性時相反應蛋白，它受到外界高濃度的3價鐵Fe3+，在短時間內(nèi)大量合成鐵蛋白來抵抗應激，防止鐵過量對玉帶鳳蝶幼蟲造成氧化損傷.在桔小實蠅的人工飼料中添加1.8 mg/g FeCl3后，BdFer1HCH和BdFer2LCH的表達量顯著上調(diào)[9].鐵調(diào)控蛋白(IRP)能夠與鐵蛋白重鏈亞基5’UTR的鐵反應原件(IRE)相互作用，控制鐵蛋白的翻譯.因此，當細胞內(nèi)鐵濃度過高時，IRP2迅速退化，不再與IRE結(jié)合，同時轉(zhuǎn)鐵蛋白受體減少.當細胞內(nèi)鐵濃度較低時，IRP與IRE結(jié)合，抑制鐵蛋白翻譯和提高轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的合成[30-31].這些結(jié)果進一步表明PpFerHCH和PpFerLCH在調(diào)控機體內(nèi)鐵離子的平衡過程中起著重要作用.

本研究以鳳蝶科的玉帶鳳蝶為材料，基于基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定了鐵蛋白重鏈亞基PpFerHCH和輕鏈亞基基因PpFerLCH，并且克隆出2個基因的開放閱讀框.采用熒光定量PCR分析PpFerHCH和PpFerLCH的組織表達模式和相應鐵離子刺激后的表達水平，以闡明玉帶鳳蝶鐵蛋白基因的表達調(diào)控機制，為進一步明確玉帶鳳蝶鐵蛋白的功能奠定基礎.