陳 慧，陳玉梅，胡招娣，楊 潮

(贛南師范大學 生命科學學院，江西 贛州 341000)

癌癥是威脅人類身體健康最嚴重的疾病之一，對癌癥的預防和有效治療已成為當今世界最具有挑戰(zhàn)性的課題.在諸多癌癥類型中，肺癌是一類最為常見的惡性腫瘤，其病理類型包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌[1].世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)顯示，在2018 年肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，約有 210 萬肺癌新發(fā)病例，而因肺癌死亡的患者人數(shù)高達176 萬人[2].在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率也同樣位居所有癌癥的首位，2015年我國肺癌新發(fā)病例高達78.7萬人，死亡人數(shù)則達到63.1萬人[3].目前，早期肺癌可通過手術成功切除，中晚期肺癌則需要放化療治療[4].但隨著化療次數(shù)增多，耐藥率越來越高，目前晚期肺癌尚無理想治療的方法.因此，深入研究肺癌的耐藥機制，對肺癌的化學預防和治療具有重要意義.

阿霉素(Doxorubicin，Dox)是一種廣譜性的抗腫瘤抗生素，通過抑制細胞中RNA 和DNA的合成，實現(xiàn)對癌細胞的殺傷.但在治療過程中，長期使用Dox常會導致癌細胞發(fā)生耐藥性.為了深入研究肺癌獲得性Dox耐藥的分子機制，構建穩(wěn)定的耐藥細胞模型是開展這方面研究的基礎.本研究采用濃度梯度遞增的誘導方式建立人肺癌細胞H1299 Dox耐藥細胞株H1299 R，并對其耐藥性進行初步鑒定，包括比較耐藥細胞株H1299 R和野生型細胞H1299 W形態(tài)特征、增殖曲線；Real-time PCR檢測耐藥細胞株H1299 R和野生型細胞H1299 W與癌細胞產(chǎn)生耐藥性、發(fā)生轉移和侵襲相關的基因表達量.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

人肺癌H1299細胞株由中國科學院干細胞庫提供.

1.1.2 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco 公司)；10×PBS和胰酶TEMED(碧云天生物技術公司)；阿霉素(Doxorubicin)、二甲亞基砜(DMSO)和引物合成(上海生工生物工程有限公司)；逆轉錄試劑盒(Takara公司)；Trizol 和2×SYBR Green Mix(百泰克生物公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人肺癌H1299細胞株選用含10% FBS和1%抗生素的1 640培養(yǎng)基，置于37 ℃和5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 耐藥細胞株的建立

采用濃度梯度遞增法處理人肺癌H1299細胞，使用的阿霉素濃度依次為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL，連續(xù)培養(yǎng)6個月，獲得耐藥細胞株H1299 R.具體步驟如下:阿霉素的使用濃度從0.1 μg/mL開始，加藥24 h后換液，細胞穩(wěn)定3～5 d后再進行傳代.待細胞呈對數(shù)生長時再次添加與之前相同濃度的藥物處理，照該步驟重復3遍后再開始增加藥物濃度，每傳2～3代逐步提高阿霉素濃度，提高的濃度梯度以每次提高濃度后72 h存活細胞比例達80%以上，最終篩出耐藥細胞株H1299 R.

1.2.3 MTT實驗

取對數(shù)生長期H1299 W和H1299 R細胞，以3 000個/孔(耐藥增殖實驗則以5 000個/孔)的量接種于96孔板(同時設置3-5個復孔，)，分別培養(yǎng)1、2、3和4 d后進行OD值檢測.耐藥增殖實驗則在細胞接種時，在培養(yǎng)液中直接添加終濃度為5 μg/mL阿霉素.檢測時每孔加入20 μL 5mg/mL的MTT 溶液，與細胞培養(yǎng)4 h后去除舊培養(yǎng)液，PBS清洗1次，每孔加入200 μL DMSO，避光置于水平搖床上震蕩10 min.在490 nm處檢測吸光度(A)值，記錄數(shù)據(jù)后繪制H1299 W和H1299 R的生長曲線.

1.2.4 熒光定量PCR實驗

提取未處理的肺癌細胞H1299 W和耐藥細胞H1299 R的總RNA，使用逆轉錄試劑盒進行反轉錄實驗獲得相應樣本的cDNA.以cDNA為模版，進行熒光定量PCR實驗，檢測H1299 W和H1299 R細胞中β-actin、MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin等基因的mRNA表達水平.所采用引物序列如表1：

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)通過Excel 2003軟件進行分析，采用T-Test參數(shù)比較不同組別的差異性，其中0.001≤P≤0.01具有高度統(tǒng)計學意義，標注為**，P≤0.001具有顯著性差異，標注為***.

2 結果與分析

2.1 Dox處理人肺癌H1299細胞形態(tài)的變化

倒置熒光顯微鏡下觀察人肺癌H1299 W和H1299 R細胞的形態(tài)時，發(fā)現(xiàn)H1299 R細胞形態(tài)較H1299野生型細胞的形態(tài)發(fā)生了較大變化，細胞大小、形態(tài)均發(fā)生變化，細胞更細長，細胞內(nèi)尤其是近胞膜處有較多深色物質(zhì)聚集(圖1).

圖1 H1299 W 和H1299 R細胞形態(tài)

2.2 細胞增殖曲線測定

耐藥性細胞株H1299 R和野生型細胞H1299在相同條件下培養(yǎng)4 d.MTT法檢測耐藥性細胞株H1299 R和H1299野生型細胞,增殖未產(chǎn)生一定的差異(見圖2).

圖2 H1299 W 和H1299 R細胞增殖曲線

2.3 Dox對H1299 W和H1299 R細胞毒性的檢測

耐藥性細胞株H1299 R和H1299野生型細胞在Dox藥物的處理下培養(yǎng)4 d，MTT法檢測細胞增殖情況。由圖3可看出，用5 ug/ml Dox處理細胞后，耐藥性細胞株H1299 R細胞增殖曲線仍呈現(xiàn)上升趨勢，但是增長緩慢；而H1299野生型細胞的細胞數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢.

圖3 DOX處理H1299 W 和H1299 R的細胞增殖曲線

2.4 H1299 W和H1299 R的細胞中耐藥基因和轉移性基因表達差異

為了考察耐藥細胞株H1299 R的基因變化情況，收集耐藥性細胞株H1299 R和H1299野生型細胞的RNA樣本，經(jīng)反轉錄后進行Real-time PCR檢測.實驗結果發(fā)現(xiàn)耐藥性細胞株H1299 R中與癌癥耐藥、轉移和上皮間質(zhì)轉化相關基因如MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的mRNA表達水平均高于H1299野生型細胞組，呈顯著性差異且具有統(tǒng)計學意義(見圖4).

圖4 腫瘤耐藥性相關基因在H1299 W和H1299 R中的mRNA表達水平

3 討論

阿霉素(Adriamycin)是一種蒽環(huán)類抗菌化學藥物，對細胞增長具有抑制作用，其在結構上與柔紅霉素相類似[5]，在各種惡性腫瘤臨床治療中具有重要的作用.它作為一種新型抗腫瘤藥物，在實體瘤(乳腺癌、惡性肉瘤、支氣管癌和神經(jīng)母細胞瘤)以及血液學惡性腫瘤(惡性淋巴瘤和急性白血病)中抑制細胞的增殖[6].阿霉素抑制腫瘤細胞的增殖的作用機制是，其本身可插入DNA雙鏈結構中，使雙鏈DNA的結構發(fā)生改變，另外，其可抑制拓撲異構酶Ⅱ的功能，導致DNA的結構損傷，使得腫瘤細胞凋亡[7].阿霉素雖有作用機制清晰、費用便宜等優(yōu)點，但在臨床應用中仍被發(fā)現(xiàn)會導致癌癥患者的耐藥性產(chǎn)生，影響治療效果.

多藥耐藥是目前腫瘤細胞免受化療藥物攻擊的最重要的細胞防御機制[8].MDR1基因的過表達是腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的主要機制之一[9].MDR1可通過水解ATP獲取能量，將細胞中的化學藥物排出癌細胞外，以減少癌細胞內(nèi)的化學藥物濃度，從而使細胞產(chǎn)生耐藥性[10].有研究證實，通過RNA干擾技術沉默 MDR1 基因表達，可提高多種腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，如肺癌、乳腺癌等[10-11].除此之外，在一些新輔助治療和手術后輔助治療中使用一些紫杉類藥物，使腫瘤患者在疾病復發(fā)轉移時往往會對這類藥物產(chǎn)生耐藥[12-13].已有研究評估治療非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)的腫瘤藥物氨柔比星(amrubicin)的活性，發(fā)現(xiàn)該藥物難以治愈復發(fā)性的小細胞肺癌[14].近年來，篩選耐藥細胞株已成為研究者研究工作的重要研究工具，研究者們運用耐藥細胞株來揭示腫瘤細胞的耐藥機制，為治療腫瘤提供更有效的方法.因此，建立癌細胞的耐藥細胞株在科研工作中具有重要意義.

本實驗首先建立了人肺癌阿霉素耐藥性細胞株H1299 R，在熒光倒置顯微鏡下觀察到H1299 R細胞形態(tài)較野生型細胞H1299 W的形態(tài)發(fā)生了較大變化，細胞大小、形態(tài)均發(fā)生變化，細胞更細長，細胞內(nèi)尤其是近胞膜處有較多深色物質(zhì)聚集.MTT法檢測出在正常情況下培養(yǎng)耐藥性細胞株H1299 R和H1299野生型細胞增殖未產(chǎn)生一定的差異，而Dox對H1299 W 和H1299 R細胞毒性存在顯著性差異.Real-time PCR研究結果也發(fā)現(xiàn)耐藥性細胞株H1299 R中與癌細胞耐藥性、轉移和侵襲相關基因MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin基因mRNA的表達量均高于野生型細胞H1299 W組.這些結果預示著細胞耐藥性增強可能是這些基因表達增加，也可能存在多種基因共同通過不同的信號通路對癌細胞所用化療藥物產(chǎn)生耐藥性.本研究建立人肺癌細胞H1299 Dox耐藥細胞株H1299 R，并對其耐藥性進行初步鑒定，為深入研究肺癌獲得Dox耐藥的分子機制奠定了基礎.