程康文，李佳，王貴和，束寬山，鄭明，馬冬花

（安徽省銅陵市人民醫(yī)院 1.胃腸外科 2.病理科 3.護理部，安徽 銅陵 244000）

術前新輔助放化療（neoadjuvant chemoradiotherapy，nCRT）是治療中低位局部進展期直腸癌的金標準，提高了保肛率、降低局部復發(fā)率[1]。與術前單獨放療相比，氟尿嘧啶聯(lián)合術前放療可增加腫瘤退縮，10%～15%患者nCRT后出現(xiàn)病理完全緩解（pathologic complete remission，pCR）[2]，而pCR的患者可以獲得更好的長期生存。盡管有新的分子生物學認識和治療技術進展，但對nCRT前預測腫瘤病理退反應的潛在生物標志物了解甚少，每個患者和腫瘤又有不同的分子特征；因此，目前在分子水平的研究非常有限。

據(jù)估計15%的散發(fā)性結直腸患者存在錯配修復（mismatch repair，MMR）基因的缺陷導致MMR蛋白表達缺失或功能異常，影響DNA復制過程中的保真性和遺傳的穩(wěn)定性，引起重復短小序列的核苷酸增加或缺失，這種現(xiàn)象被稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）[3]。MMR蛋白主要包括MLH1蛋白、MSH2蛋白、MSH6蛋白、PMS2蛋白，其中一種以上蛋白表達缺失稱為MMR缺失（deficient MMR，dMMR），否則稱為MMR完整（proficient MMR，pMMR）。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（NCCN）指南建議，推薦MSI或MMR蛋白檢測用于所有結直腸癌患者[4]。目前，大多數(shù)中心通過免疫組化染色來檢測MMR的表達情況，免疫組化染色和PCR檢測方法在檢測上幾乎是同樣有效[5]?，F(xiàn)已證實dMMR/MSI對II期結腸癌術后氟尿嘧啶輔助化療耐藥[6]，但是MMR蛋白對局部進展期直腸癌nCRT療效不明，而評估MMR蛋白表達和nCRT敏感性、nCRT病理反應之間關系的研究較少。本研究通過觀察腸鏡初診MMR蛋白的表達情況，評估MMR與nCRT的療效關系，分析腫瘤退縮反應相關的臨床病理因素和預測pCR的有效指標，更準確地評估對nCRT的療效，從而篩選出對nCRT敏感的直腸癌患者，最終為個體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2014年1月—2019年12月在銅陵市人民醫(yī)院胃腸外科住院治療的直腸癌患者。入選標準：⑴ 原發(fā)性中低位直腸癌患者，且均經(jīng)腸鏡病理明確診斷；⑵ 腸鏡活檢組織標本符合免疫組化檢測要求；⑶ 參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）的TNM第8版分期標準[7]，均為T3期以上或/N+患者，需行nCRT；⑷ 隨訪資料完整可靠。排除標準：⑴ 腸鏡活檢前接受過全身化療或盆腔放療；⑵ nCRT后未實施直腸癌根治術患者。共入選162例直腸癌患者，其中男109例，女53例；年齡45～71歲，中位年齡59歲；病灶下緣距肛門5 cm以內(nèi)62例，超過5 cm以上100例；高/中分化腺癌共 130例，低分化腺癌/未分化共32例；黏液腺癌28例，非黏液腺癌134例；T2期29例，T3期78例，T4期55例；N0期50例，N1期78例，N2期34例；CEA＜5 ng/mL 103例，≥5 ng/mL 59例，卡培他濱單藥方案化療32例，Capeox方案化療130例。本研究獲得銅陵市人民醫(yī)院倫理委員會批準，且入組患者均簽署知情同意書。

1.2 nCRT方案

采用長程分割放療，放療25～28次，每次劑量1.5～1.8 Gy，總劑量45～50.4 Gy；化療方案采用以卡培他濱口服為基礎的方案（同步化療方案以口服卡培他濱825 mg/m2，每日2次/周5次；或Capeox方案）；nCRT結束后間隔5～12周接受根治性手術。

1.3 免疫組化染色

初診活檢組織的免疫組化染色采用S-P染色按試劑盒說明書操作，主要操作步驟如下：所有組織均經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋后連續(xù)切片，貼于涂膠玻片上，經(jīng)烤片、脫蠟、抗原修復、漂洗后，一抗4℃過夜，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS 沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，蘇木精復染[8]。以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為MLH1、MSH2、MSH6、PMS2陽性細胞，MMR蛋白陰性為表達缺失或＜10%核染色，陽性為≥10%核染色[9]。免疫組化結果評分由2名醫(yī)師獨立完成。

1.4 nCRT后療效評估

采用改良后的實體瘤療效評價標準（RECIST 1.1）進行療效評估，分完全緩解（complete response，CR）：所有目標病灶消失，維持至少4周；部分緩解（partial response，PR）：基線病灶長徑總和縮小30%以上，維持至少4 周；疾病進展（progressive disease，PD）：基線病灶長徑總和增加20%以上或出現(xiàn)新病灶；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）：靶病灶最大徑之和縮小未達PR，或增大未達PD[10]，有效率=（PR+CR）/（PR+CR+SD+PD）×100%。

1.5 nCRT后病理學評估

按照AJCC第8版推薦的腫瘤退縮分級（tumor regressive grading，TRG）評估方法：0完全退縮，無鏡下可見的腫瘤細胞；1 接近完全退縮，鏡下僅見單個或小灶腫瘤細胞；2部分退縮，有明顯退縮，但殘余腫瘤細胞多于單個或小灶腫瘤細胞；3 無退縮，殘余腫瘤范圍廣泛，無明顯退縮[7]。根據(jù)TRG評分將患者分為3組：無反應組（TRG 3分）；中間反應組（TRG 1～2分）；完全反應組（TRG 0分）。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料的統(tǒng)計方法采用χ2檢驗；Logistic回歸模型進行多因素分析。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 MMR蛋白的表達情況

162例直腸癌患者中22例（13.4%）存在dMMR，其中MLH1蛋白缺失17例（10.5%）、MSH2蛋白缺失10例（6.2%），MSH6蛋白缺失 8例（4.9%），PMS2蛋白缺失11例（6.8%）（圖1）。

圖1 直腸癌患者腫瘤組織MMR蛋白免疫組化染色（×200）Figure1 Immunohistochemical staining for MMR proteins in tumor tissue of the rectal cancer patients (×200)

2.2 患者MMR蛋白表達狀態(tài)與患者臨床資料及nCRT后療效的關系

患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、術前臨床分期、CEA水平與dMMR均無明顯關系（均P＞0.05），而組織學類型、術前臨床分期、TRG評分與dMMR有關（均P＜0.05)。nCRT后RECIST 1.1評估dMMR組有效率高于pMMR組（59.1% vs.36.4%，P＜0.05），表明nCRT后有效率與dMMR密切有關（表1）。

表1 dMMR 與pMMR 患者的臨床資料及nCRT療效的比較[n（%）]Table1 Comparison of the clinicopathologic characteristics and nCRT efficacy between dMMR and pMMR patients [n (%)]

2.3 TRG 與患者臨床病理特征的關系

根據(jù)TRG評分結果，無反應組64例、中間反應組74例、完全反應組24例。患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、組織學類型、CEA水平、同步化療方案、MLH1蛋白表達、MSH2蛋白表達、MSH6蛋白表達、PMS2蛋白表達與TRG無明顯關系（均P＞0.05）；臨床T分期、臨床N分期、術前臨床分期、MMR蛋白的表達狀態(tài)（dMMR和pMMR）與TRG有關（均P＜0.05）（表2）。

2.4 影響直腸癌患者pCR的多因素分析

對表2中與nCRT后TRG反應相關的臨床T分期、臨床N分期、術前臨床分期及MMR蛋白表達狀態(tài)，帶入到Logistic回歸模型進行多因素分析。結果發(fā)現(xiàn)dMMR是直腸癌患者pCR的獨立影響因素（OR=0.327，95% CI=0.109～0.984，P=0.047）（表3）。

表2 TRG 不同分組患者臨床病理特征的比較[n（%）]Table2 Comparison of the clinicopathologic characteristics among groups of patients with different TRG scores [n (%)]

表3 pCR 獨立影響因素的多變量Logistic 回歸分析Table3 Multivariate Logistic regression analysis of independent influential factors for pCR

3 討 論

結直腸癌是全球第三大最常見的癌癥，也是導致男性和女性癌癥相關死亡的第四大原因[11]。局部進展期直腸癌的標準治療方法是nCRT，然后進行全直腸系膜切除，以提高根治性切除、肛門括約肌保留和腫瘤局部控制?？紤]到部分直腸癌患者經(jīng)過nCRT后可達到pCR的效果，并且手術可能會導致性功能、排尿排便功能的受損；因此，其它的替代治療方法如“等待觀察”策略或經(jīng)肛門局部切除已被推薦[12]。另一方面，對nCRT不敏感的患者需要盡早更換有效的治療方法。因此，早期預測對nCRT不敏感的生物標志物至關重要，這使受益于nCRT的直腸癌患者得到篩選，并避免無效nCRT相關的毒性，從而提供精準的個體化治療方案。

本研究通過術前腸鏡病理活檢組織的免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)162例直腸癌患者中共22例（13.4%）存在dMMR。目前國內(nèi)關于大樣本研究直腸癌中MMR表達情況較少，國外報道直腸癌中MMR缺失率約7.8%～13.4%[13-15]。Hasan等[14]分析了5 086例局部進展期直腸癌患者術后標本，其中4 450例（87%）MSI（-）、636例（13%）MSI（+）。本研究結果與目前報道的MMR蛋白總缺失比例基本一致，直腸癌組織標本中MMR蛋白缺失比例不一致，需考慮到免疫組化的技術水平、腫瘤組織異質(zhì)性所致。關于直腸癌患者MMR蛋白缺失的具體類型，目前相關研究仍較少。國外有研究表明62例dMMR直腸癌患者中，最常見的MMR蛋白缺失是MSH2占33例（53%），其次是MSH6占14例（23%），最后是MLH1占10例（16%)和PMS2占5例（8%）[16]。Acar等[13]研究了341例接受nCRT后手術的直腸癌患者，IHC發(fā)現(xiàn)dMMR患者占76例（13.4%），其中主要是以MLH1蛋白、PMS2蛋白缺失為主；Meillan等[15]報道296例患者中，23例（7.8%）存在MMR缺失，MSH2缺失 8例，MLH1缺失6例，MSH6缺失3例，PMS2缺失1例，MLH1和MLH2都缺失2例，MSH2和MSH6都缺失2例。MLH1/PMS2結合形成異源二聚體可識別錯配位點，參與錯配修復[17]；有研究[18]表明，MSH6蛋白在MSI結直腸癌中表達的缺失可能是由于MLH1/PMS2缺失，導致MSH6基因內(nèi)編碼多聚胞嘧啶發(fā)生繼發(fā)性突變所致。因此，MMR蛋白之間缺失的關系仍需進一步研究。

根據(jù)MMR蛋白表達狀態(tài)進行一般資料單因素分析，結果表明組織學類型中黏液腺癌更容易檢測出dMMR，提示MMR蛋白與直腸癌組織學之間存在相關性，具體需進一步研究。而對于術前臨床分期與dMMR相關性，考慮到直腸癌nCRT分期條件；因此，術前臨床分期與MMR之間相關性可能存在選擇偏倚。而dMMR組病理退縮反應更明顯、RECIST 1.1評估有效率更高，均提示dMMR組對nCRT敏感性高。

TRG是評價nCRT治療后反應的一種有效方法[19]。有研究[20-21]表明年齡對直腸癌患者nCRT后的TRG沒有影響，但男性對nCRT有更好的反應，腫瘤分化程度高與nCRT反應良好相關。而本研究結果并未發(fā)現(xiàn)性別、年齡及腫瘤分化程度與TRG之間存在相關性，可能仍需進一步擴大樣本量。CEA水平對TRG的影響仍存在爭議，有研究[22]表明高CEA水平意味著較重的腫瘤負荷，可能需要較高的放療劑量才能達到相同的腫瘤反應和預后；也有研究[18]表明CEA水平對TRG沒有影響。黏液性直腸癌是指過量的細胞外黏液，組成超過50%腫瘤體積，研究[23]表明黏液組織是局部進展期直腸癌nCRT后反應差的可靠生物學標志物。一項供納入6 555例直腸癌患者的回顧性研究表明：相比普通腺癌，黏液腺癌患者更難以達到pCR（OR=0.68，P=0.008）[24]。本研究結果亦未發(fā)現(xiàn)黏液性直腸癌與TRG之間存在關系，可能因病例樣本量小導致結果偏倚。進展期臨床T分期常與腫瘤大小有關，是局部進展期直腸癌nCRT后效果的重要預后因素；而影響腫瘤細胞的放療生物學效果，取決于腫瘤大小，這可能部分解釋了臨床T分期與TRG之間的關系[13]；既往研究還發(fā)現(xiàn)cN0是pCR的獨立預測因子[25]。因此，臨床分期與nCRT后的TRG相關。本研究通過評估患者nCRT后病理退縮反應進行分組，結果發(fā)現(xiàn)：完全病理緩解組中T2分期與 N0分期比例較多，而病理無反應組中T3、T4分期與N2分期患者較多；完全病理緩解組中II期患者比例較多，而病理無反應組中III期患者較多，上述差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步多因素分析發(fā)現(xiàn)臨床T分期、臨床N分期及臨床分期與pCR之間無獨立相關性。而Hosseini等[26]回顧性研究403例局部進展期直腸癌患者，通過單因素分析也發(fā)現(xiàn)更高的腫瘤分期可預測nCRT后較低的pCR發(fā)生率（P=0.049）?？紤]病例資料的差異、腫瘤的異質(zhì)性及相關混雜因素影響，目前關于臨床分期與pCR之間關系仍需進一步分層研究。

本研究顯示完全反應組中dMMR所占比例高，進一步通過Logistic回歸模型進行多因素分析，證實dMMR是直腸癌患者pCR的獨立影響因素；同時術前應用RECIST 1.1療效評估表明dMMR組nCRT有效率亦高于pMMR組的（59.1% vs.36.4%，P＜0.05）。以上結果提示dMMR 可以預測nCRT后腫瘤組織病理退縮反應良好。Meillan等[15]報道 296例接受nCRT的局部進展期直腸癌患者，dMMR患者有較高的病理降期率（P＜0.0001）和腫瘤病理退縮程度（P=0.024），表明dMMR患者可能對放療更敏感。de Rosa等[16]報道以氟尿嘧啶為基礎nCRT的29例dMMR直腸癌患者，術后完全病理緩解率為27.6%（8/29），剩下的除1例患者外都出現(xiàn)nCRT后降期；因此，dMMR患者對nCRT的敏感性增高，腸鏡檢查中活檢組織中MMR蛋白表達狀態(tài)的評估，可以預測患者對nCRT的敏感性。

目前關于MMR蛋白表達狀態(tài)對直腸癌nCRT的療效預測存在爭議，最近國外一項對3 7例接受nCRT的患者進行回顧性評價，IHC結果表明33例（89.2%）患者中MLH1和MSH2陽性，其中7例TRG評分為0分；4例（10.8%）患者為dMMR（MLH1和或MSH2缺失），均可見到腫瘤組織肉眼殘留；統(tǒng)計學結果表明MLH1、MSH2蛋白表達狀態(tài)對腫瘤退縮反應無差異（P=0.570）[27]。Demes等[28]也發(fā)現(xiàn)直腸癌中MMR缺失與以氟嘧啶為基礎的nCRT療效之間無相關性。以上研究均為直腸癌中MMR表達狀態(tài)與nCRT療效之間無關，但上述研究均為單中心小樣本，其中Demes等[28]僅研究了2例MMR缺失直腸癌患者，研究結果均缺乏強有力依據(jù)。Hasan等[14]分析了5086例局部進展期直腸癌患者，MSI（-）患者pCR率為8.9%，MSI（+）患者pCR率為5.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01）；多因素分析提示MSI（+）患者是pCR一個獨立的預測因子，可減少病理完全緩解（OR=0.65，P=0.03）。本研究結果與上述研究相反，進一步分析原因發(fā)現(xiàn)該研究中微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-L）組pCR率為4.3%（OR=0.46，P=0.02），微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）組pCR率為8.1%（OR=0.90，P=0.74），表明僅MSI-L可以降低pCR率；而本研究僅通過免疫組化分析MMR蛋白表達狀態(tài)，并未進行基因檢測來定義MSI-L，可能存在dMMR患者中MSI-L患者比例低；且dMMR組定義包括MMR蛋白表達＜10%核染色患者，可能存在將部分微衛(wèi)星穩(wěn)定患者納入dMMR組中。此外，上述研究對象大部分是白人和非裔美國人，種族差異及病例資料的異質(zhì)性可能對研究結果有一定影響。

直腸癌對nCRT的病理退縮反應，是術前放療和化療的綜合結果，而不僅僅是化療的結果所致[20]，放療對nCRT的病理退縮反應至關重要。越來越多的證據(jù)表明，MMR蛋白可能影響和（或）直接參與輻射誘導的DNA損傷反應后的DNA雙鏈斷裂修復，相關研究[29]表明放療損傷后，MLH1和MSH2可能直接或間接參與DNA損傷反應的多個步驟：識別DNA雙鏈斷裂到隨后通過轉導分子介導信號傳導，誘導和維持細胞周期的阻滯；實時修復DNA雙鏈斷裂和暫時性抑制細胞凋亡；在恢復細胞周期之前保證修復后的DNA完整；如DNA雙鏈斷裂修復失敗則讓細胞轉向死亡程序。MSH2主要是和MSH6形成復合物，負責修復DNA堿基錯配[18]。因此，dMMR可促進直腸癌放療敏感性，因為dMMR表型缺乏必要的機制來修復放療誘導的DNA雙鏈斷裂。具有MSI表型的細胞系對放療敏感性已得到證實，缺乏MSH2的原代人細胞對DNA鏈間交聯(lián)劑沒有反應，但對輻射卻表現(xiàn)出細胞活力下降[30]。目前，關于MMR蛋白對nCRT的敏感性影響的機制仍需開展臨床和基礎研究。

綜上所述，直腸癌腸鏡檢查活檢組織中dMMR表型，提示該部分患者對nCRT敏感，腫瘤組織病理退縮反應良好，可以作為直腸癌nCRT有效的預測指標?？紤]到本組資料中dMMR患者較少，且為回顧性研究，未來仍需開展大樣本、前瞻性對照研究去證實。