徐 瑋，毛樂寶，陳苗苗*，張修華，王升富

(1.武漢食品化妝品檢驗所，湖北武漢 430012；2.湖北大學化學化工學院，有機功能分子合成與應用教育部重點實驗室，湖北武漢 430062)

β2-興奮劑是一類化學合成的苯乙醇胺類衍生物[1]。一方面，它可用于預防運動性哮喘，治療哮喘和慢性支氣管炎等疾病[2,3]，另一方面，β2-興奮劑在畜牧業(yè)中常被用作生長促進劑，通過減少胴體脂肪、增加肌肉質量來提高生長速度和飼料轉化率[4-6]。但是，β2-興奮劑的濫用及在動物可食用組織中的殘留會嚴重威脅人體健康[7]，可能引起心率加快、肌肉振顫、嘔吐和發(fā)燒等急性中毒癥狀[8,9]。因此，許多國家通過立法來限制或禁止β2-興奮劑在食用動物養(yǎng)殖中的使用。近年來，研究人員建立了各種用于β2-興奮劑定量檢測的分析方法，包括高效液相色譜(HPLC)[10]、薄層色譜(TLC)[11]、氣相色譜-質譜(GC-MS)[12]、毛細管電泳(CE)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等技術[13,14]。雖然這些檢測方法性能優(yōu)異，但仍存在成本高、過程復雜、耗時較長、穩(wěn)定性不足等缺陷。因此，建立簡便、快速、高靈敏、低成本的β2-興奮劑檢測方法，對人體及動物健康和食品安全控制至關重要。

分子印跡技術因其具有超高的特異性識別能力而廣泛應用在分離、化學傳感和催化等領域[15-19]?；诜肿佑≯E聚合物(MIPs)的新型傳感器在分析檢測中也展現出顯著優(yōu)勢，例如傳感器制備簡便且價格低廉、可共聚單體的選擇靈活以及對功能性結合腔壁的可定制性等。另外，由于大多數興奮劑藥物含有電活性基團，容易在電極表面發(fā)生氧化還原反應，因此電化學傳感方法在興奮劑的檢測研究領域也扮演著十分重要的角色[20-23]。綜上，將電化學方法與分子印跡技術相結合，建立高靈敏高選擇性的分子印跡電化學(MIP-EC)傳感器，實現β2-興奮劑的高效檢測具有重要意義。

本文在單壁碳納米管(SWCNTs)修飾電極的基礎上，利用氧化銻錫(ATO)良好的導電性及其與硅溶膠相結合制備了11種β2-興奮劑MIP-EC傳感器。通過引入SWCNTs作為傳感界面，有效增強了電子傳輸速率和傳感器的靈敏度；分子印跡膜提供特定結合位點用于選擇性識別和富集β2-興奮劑分子。采用掃描電子顯微鏡(SEM)對傳感器構建過程進行了形貌表征，用循環(huán)伏安法(CV)詳細研究了β2-興奮劑在該傳感器表面的電化學行為，并優(yōu)化了影響傳感性能的關鍵實驗參數，通過11種β2-興奮劑分子的洗脫與培養(yǎng)均實現了它們在一定濃度范圍內的線性檢測。以克倫特羅(CLE)為模板分子，證明了在其他結構類似物和潛在干擾物存在下，該傳感器仍表現出優(yōu)異的抗干擾性能，并成功應用于人血清實際樣品中目標分子的加標回收測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司)；JSM-5510LV掃描電子顯微鏡(SEM)(日本，JEOL)；超聲波清洗儀(RANSON2000，美國)；LE438 pH計電極(瑞士，Mettler-Toledo)；AWJ1-0501-U艾科浦超純水機(美國)；三電極系統(tǒng)：以裸露的玻碳電極(GCE，直徑3 mm)或改良的GCE作為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參考電極，鉑電極作為輔助電極。

β2-興奮劑(沙丁胺醇(SAL)、特布他林(TER)、奧西那林(MET)、異克舒令(ISO)、利托君鹽酸鹽(RIT)、萊克多巴胺(RAC)、非諾特羅(FEN)、西布特羅(CIM)、馬布特羅(MAB)、溴布特羅(BRO)、克倫特羅(CLE))和十二烷基硫酸鈉(SDS)，均購自國藥集團化學試劑有限公司和生物制品控制研究所(上海)。四乙氧基硅烷(TEOS)(美國，Sigma)；氧化銻錫(ATO)(美國，Sigma)；SWCNTs購自成都有機化工有限公司。所有化學藥品均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 MIP-EC傳感器的制備

將1.5 mg的SWCNTs加入3.0 mL 5.0 mmol/L的SDS溶液中，并超聲攪拌40 min進行分散，得到均勻的SWCNTs懸浮液。然后，將5.0 μL SWCNTs懸浮液滴涂在清潔的GCE的表面上，并在室溫下自然干燥。

傳感器的制備是在合理設計和優(yōu)化的基礎上進行的。首先將ATO與硅溶膠以質量比為1∶3混合，并將混合溶液在25 ℃下攪拌1 h獲得到均勻的溶膠。取300.0 μLβ2-興奮劑(0.01 mol/L)加入到1.0 mL溶膠中，混合1 h獲得溶膠-凝膠(sol-gel)MIPs。最后，通過將5.0 μL溶膠-凝膠MIPs滴涂在SWCNTs/GCE的表面過夜處理，并通過乙醇洗脫β2-興奮劑獲得MIP-EC傳感器。在相同的實驗條件下，不添加模板分子β2-興奮劑獲得非印跡的電化學(NIP-EC)傳感器。

1.3 實驗方法

采用三電極體系在CHI660C電化學工作站上進行測量。電解質溶液為pH=7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，采用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法，掃描速度為0.1 V/s。血清樣品的制備過程為取5 mL人血清，在37 ℃下放置5 min后加入2 mL的甲醇，離心5 min(3 000 r/min)。然后取上層清液，加入20 mL超純水稀釋。

2 結果與討論

2.1 MIP-EC傳感器的表面形貌表征

采用SEM表征了SWCNTs/GCE和MIP/sol-gel/SWCNTs/GCE的形貌。如圖1A所示，SWCNTs均勻分布在GCE表面，呈纖維網狀結構。經過進一步修飾和處理，將MIP/sol-gel膜固定在SWCNTs修飾電極表面(圖1B)，可以看到碳納米管明顯被一層印跡膜所覆蓋，并且膜的表面平整和均一，這也表明了改性的GCE表面和溶膠-凝膠聚合物膜之間優(yōu)異的界面相容性。

圖1 SWCNTs/GCE(A)和MIP/sol-gel/SWCNTs/GCE(B)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of the SWCNTs/GCE(A) and MIP/sol-gel/SWCNTs/GCE(B)

2.2 MIP-EC傳感器的電化學行為

為了進一步研究MIP-EC傳感器，采用CV法對傳感器及不同修飾電極進行表征(圖2(A))。結果顯示11種β2-興奮劑在0.6～0.85 V的電位范圍內均表現出相似的電化學響應。以CLE為例，在0.79 V處觀察到明顯的氧化峰(曲線a)，說明了大量CLE分子已經成功地嵌入到了印跡膜中，因此修飾電極的電活性增強。但是當用乙醇反復洗脫CLE分子時，在相同條件下進行CV掃描，觀察到峰電流大幅降低(曲線b)，這是由于大部分模板分子CLE在洗脫過程中已成功從印跡膜上脫離，因此電化學響應減弱。

通過將MIP-EC傳感器在CLE溶液中重新培養(yǎng)，用以評估傳感器對CLE的檢測可行性(圖2(B))。將洗脫后的傳感器浸泡在5.0 μmol/L的CLE溶液中孵育10 min，此時其在0.79 V處的氧化峰電流顯著增強(曲線a)，這是因為印跡膜上具有與模板分子CLE分子結構匹配的記憶位點，可以特異性結合并富集電活性目標分子，從而使電流信號增大。作為對照，NIP-EC傳感器在同濃度的目標分子溶液中培養(yǎng)后，電流信號非常微弱(曲線c)，這可能是由于少量的CLE分子被非特異性吸附在非印跡膜上造成的。此外，研究結果還表明SWCNTs功能性單層膜的存在直接影響傳感器的電流響應性能。當分子印跡溶膠-凝膠聚合物未與SWCNTs結合時(曲線b)，其雖然也有一定的電流響應，但是遠小于有SWCNTs參與的MIP-EC傳感器的響應值(曲線a)。這是由于SWCNTs的修飾增加了電極的比表面積，有效的增加了CLE分子在印跡電極上的富集，同時也表SWCNTs可以提高傳感界面的電導率，在模板分子和電極之間的電子轉移中起關鍵作用。

圖2 (A) MIP-EC傳感器在CLE溶液中孵育前(a)后和(b)的循環(huán)伏安圖；(B)不同修飾電極在5.0×10-6 mol/L CLE溶液中孵育10 min的循環(huán)伏安曲線Fig.2 (A) Cyclic voltammograms of the MIP-EC sensor before(a) and after(b) extraction of CLE;(B) Cyclic voltammograms of different modified electrodes incubated in 5.0×10-6 mol/L CLE solution for 10 min(a.MIP-EC sensor;b.MIP/sol-gel/GCE;c.NIP-EC sensor)Scan rate:0.1 V/s;Buffer solution:0.1 mol/L PBS(pH=7.0).

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 印跡膜組成優(yōu)化印跡膜的各組分含量對MIP-EC傳感器的性能有極大的影響。溶膠-凝膠薄膜中功能性單體的作用是通過在聚合反應后保留相互作用的化學功能來協(xié)助建立特異性結合腔，該化學功能位于腔內的最佳位置，類似于酶的活性位點。ATO/硅溶膠作為分子印跡的功能化單體，可以通過氫鍵與模板β2-興奮劑相互作用，因此，ATO/硅溶膠的比例對于溶膠-凝膠薄膜非常重要。以CLE為例：通過CV法研究了印跡聚合物中ATO和硅溶膠的不同質量比例(1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶6)對印跡電極的電化學響應的影響。如圖3(A)所示，當ATO和硅溶膠的質量比例從1∶1減小到1∶3，印跡電極上CLE的響應電流伴隨ATO/硅溶膠的比例的減小而增大，即印跡電極上的CLE的含量逐漸增多并達到飽和。當ATO/硅溶膠的比例為1∶3時，印跡電極的響應電流達到最大值。當比例從1∶3進一步減小到1∶6時，響應電流略有下降，這是由于印跡膜上的空腔減少不足以富集足夠的模板分子導致的。因此選擇質量比例為1∶3的ATO和硅溶膠的混合物形成的溶膠-凝膠膜作為本實驗的最優(yōu)質量比例。

2.3.2 固含量的優(yōu)化采用CV法考察了固含量對傳感器電化學響應的影響。如圖3(B)所示，本實驗選取了固含量分別為1%、3%、5%、6%、7%、9%、15%的MIPs修飾電極，隨著固含量的增加，峰值電流逐漸增大，并當固含量達到5%時，響應電流達到最大值；當固含量繼續(xù)增加后，響應電流反而減小，這可能是由于電極表面對β2-興奮劑的結合量達到飽和，而固含量的增加會阻礙電荷的轉移。因此，選擇5%作為印跡最佳固含量。

2.3.3 緩沖溶液的pH值的優(yōu)化在不同pH的PBS中研究了MIP-EC傳感器的電流響應。如圖3(C)所示，隨著磷酸緩沖液的pH從4.0增加到9.0，峰電位逐漸負移，且峰電流值隨著pH值的變大先增加后降低。在pH=7.0時，峰值電流達到最大值，因此pH=7.0被選作后續(xù)實驗的最佳pH(圖3(C)插圖)。這可能是由于pH<7.0時，CLE可以水解，從而導致質子化模板分子離子量的減少；在pH>7.0時，CLE主要以中性分子形式存在，顯示出較低的電流響應。

2.3.4 培養(yǎng)時間的優(yōu)化培養(yǎng)過程是一個能夠有效地提高印跡電極靈敏度的步驟。實驗過程如下：首先將留有β2-興奮劑構型孔穴的MIP-EC傳感器浸入到0.5 μmol/L的β2-興奮劑溶液中培養(yǎng)不同的時間，然后用超純水沖洗電極，去除表面吸附的模板分子后，再將印跡電極置于0.1 mol/L的PBS中進行CV定量測定電流響應值。以CLE為例(圖3(D))，CLE的峰電流值隨著培養(yǎng)時間的增長而增加，當培養(yǎng)時間達到20 min后，峰電流值變化緩慢，基本維持穩(wěn)定，說明達到印跡平衡。因此，選擇20 min作為印跡最佳培養(yǎng)時間。

圖3 印跡膜成分(A)、固含量(B)、磷酸緩沖溶液的pH(C)和孵育時間(D)對分子印跡電化學傳感器電流的影響Fig.3 Influence of imprinted membrane composition(A),solid content(B),pH of PBS(C) and incubation time(D) on the response current of MIP-EC sensor

2.4 β2-興奮劑的線性檢測

在最佳條件下，測定已知濃度的β2-興奮劑溶液的濃度與響應電流的關系。以CLE為例：圖4(A)顯示了在不同濃度CLE培養(yǎng)后，MIP-EC傳感器的線性掃描伏安法(LSV)峰值電流，該峰值電流隨CLE濃度的增加而增加；圖4(B)顯示了MIP-EC傳感器和NIP-EC傳感器的標準曲線。如圖所示，對于MIP-EC傳感器，峰值電流與CLE濃度在9.9×10-8～3.9×10-5mol/L范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為：I(μA)=0.36c(μmol/L)+0.1，線性相關系數為0.998，檢測限(S/N=3)為3.3×10-8mol/L；由于NIP-EC傳感器的印跡膜缺少特異性結合位點和孔穴，很快呈現吸附飽和狀態(tài)，因此其電流響應較低，且不成線性關系。

圖4 (A)MIP-EC傳感器在CLE溶液中孵育后的線性掃描循環(huán)伏安圖；(B)MIP-EC和NIP-EC傳感器的標準曲線Fig.4 (A) Linear sweep voltammograms of MIP-EC sensor incubated in CLE solution of different concentrations;(B) Calibration curve of MIP-EC sensor and NIP-EC sensor(cCLE a to l:9.9×10-8,2.9×10-7,9.9×10-7,1.9×10-6,2.9×10-6,3.9×10-6,4.9×10-6,7.9×10-6,9.9×10-6,1.9×10-5,2.9×10-5,3.9×10-5 mol/L)

此外，使用不同分子印跡的MIP-EC傳感器對10種β2-興奮劑分別進行了檢測，均在一定濃度范圍內呈現出良好的線性關系(表1)，并具有較高的檢測靈敏度，說明了制備的MIP-EC傳感器能夠有效對β2-興奮劑進行檢測。

表1 MIP-EC傳感器對11種β2-興奮劑的檢測范圍、檢測限以及線性相關性系數Table 1 The linear range,limit of detection and linear correlation coefficient of 11 β2-agonists

2.5 MIP-EC傳感器的選擇性、穩(wěn)定性和重現性評估

在目標分子結構類似物和潛在干擾物質，包括沙丁胺醇(SAL)，特布他林(TER)，多巴胺(DA)，葡萄糖(Glu)，抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)存在下，通過CV法測定CLE溶液或CLE與干擾物質的混合溶液來研究MIP-EC傳感器的選擇性。如圖5所示，上述過量的干擾物質不會引起CLE峰值電流顯著的變化。這也表明制備的MIP-EC傳感器對β2-興奮劑有出色的的選擇性，可以用于β2-興奮劑含量的測定。這種良好的選擇性取決于印跡膜中存在與克倫特羅分子大小相匹配的孔穴以及印跡膜與CLE之間的特異性結合。

圖5 MIP-EC傳感器的選擇性Fig.5 Selectivity of the MIP-EC sensorPeak current response of MIP-EC sensor incubated in (a) 1.0×10-6 mol/L clenbuterol in 0.1 mol/L PBS;(b) a+5.0×10-5 mol/L salbutamol;(c) a+5.0×10-5 mol/L terbutaline;(d) a+5.0×10-4 mol/L DA;(e) a+1.0×10-3 mol/L glucose;(f) a+1.0×10-3 mol/L ascorbic acid;(g) a+2.0×10-4 mol/L UA.Incubation time:20 min.

采用CV法研究了MIP-EC傳感器的重現性和穩(wěn)定性。用同一支修飾電極在濃度為0.5 μmol/L的CLE模板分子培養(yǎng)溶液中培養(yǎng)20 min后，于0.1 mol/L的PBS中連續(xù)重復5次培養(yǎng)、測定、洗脫過程，其峰電流的相對標準偏差為2.1%；采用5支不同的修飾電極在0.5 μmol/L的CLE溶液中培養(yǎng)后進行測定，峰電流相對標準偏差為4.9%。將此傳感器置于冰箱中保存，該傳感器可持續(xù)重復60次培養(yǎng)、測定、洗脫過程，對同濃度CLE溶液的電流響應值幾乎不變。上述實驗結果表明，該分子印跡電化學傳感器具有良好的重現性和穩(wěn)定性。

2.6 實際樣品檢測

為探究MIP-EC傳感器的實際樣品檢測能力，實驗采取CV法對血清樣品進行加標回收測定，實驗結果如表2所示，回收率為95.0%～101.0%。表明制備的MIP-EC傳感器可以用于復雜生物樣品中目標物的檢測。

表2 人血清樣品中CLE的測定結果Table 2 Determination results of CLE in human serum sample

3 結論

本文制備了基于SWCNTs修飾的MIP-EC傳感器，實現了11種β2-興奮劑分子的高特異性高靈敏定量分析檢測。SWCNTs有效提升了傳感界面的電子傳輸速率；溶膠-凝膠MIPs洗脫后形成的空穴結合位點可選擇性識別β2-興奮劑目標分子。在最佳實驗條件下，采用循環(huán)伏安法對11種β2-興奮劑分子進行了線性檢測，證明該傳感器具有特異性高、線性范圍寬、檢測限低等優(yōu)點，對復雜實際樣品中β2-興奮劑的評估檢測表現出廣闊的應用前景。