戢凱倫，徐 瑋，王 穎，熊成義，張修華*，王升富

(1.湖北大學化學化工學院，有機功能分子合成與應用教育部重點實驗室，湖北武漢 430062；2.武漢食品化妝品檢驗所，湖北武漢 430012)

普萘洛爾(PRO)是β-受體阻滯劑之一，常被用于治療各種疾病，如高血壓、心絞痛、心律失常、心肌梗塞等[1-6]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將PRO列入基本藥物允許使用清單[7]，然而過量使用PRO會對人體產生毒副作用而嚴重威脅人體健康。此外，為防止運動員濫用藥物，國際奧委會將PRO列入了禁用藥品清單[8]。由上可知，建立PRO的高靈敏高選擇性定量檢測方法具有重要意義。目前，已有很多檢測PRO的方法被報道，包括高效液相色譜法[9]、電化學發(fā)光法(ECL)[10-12]、電化學方法[13-15]和熒光法[16]等。其中，ECL方法因其操作簡便、可控性強、靈敏度高等優(yōu)點而備受關注[17]。

分子印跡(MI)是一種通過化學合成方法制備對目標分子有特異性識別的高分子聚合物材料的技術，識別過程類似抗原-抗體、酶-底物、激素-受體。不同于生物體特異性識別體系，人工合成的分子印跡聚合物(MIPs)對過酸、過堿、高溫、有機溶劑等都有更高的抗性，因此廣泛適用于多個分析檢測領域。

圖1 PRO分子印跡電化學發(fā)光傳感器(MIP-ECL)的構建過程Fig.1 Schematic illustration for fabrication of PRO MIP-ECL sensor

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MIP-E型電子化學發(fā)光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)；CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(上海光豪分析儀器有限公司)；JEM-100SX透射電子顯微鏡(日本，JEOL)；Branson2000超聲波清洗儀(美國，Branson)。

三聯(lián)吡啶氯化釕六水化合物(北京格林凱默公司)；三丙胺、普萘洛爾、阿替洛爾、奧西那林、美托洛爾、非諾特羅(美國Sigma)；聚乙烯亞胺、曲拉通X-100、環(huán)己烷、正己醇、正硅酸四乙酯、氨水、甲醇、鐵氰化鉀、丙酮(阿拉丁試劑(上海)有限公司)；實驗用水均為二次去離子水。

1.2 RuSi@PEI NPs的制備

1.3 普萘洛爾MIP-ECL傳感器的制備

將制備好的RuSi@PEI NPs分散在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)中，然后加入0.2%的Nafion溶液，超聲使其分散均勻，取5 μL混合液滴涂在處理好的玻碳電極上，室溫下自然晾干，制備得到RuSi@PEI/GCE。MIPs的制備以PRO作為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、偶氮二異丁氰為引發(fā)劑、二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，混合均勻后，取2 μL滴涂在RuSi@PEI/GCE上，置于365 nm的紫外燈下光聚合1 min，在電極表面形成一層均勻致密的高分子聚合物膜，即制得了PRO MIP-ECL生物傳感器。

1.4 ECL的測定

ECL測定在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中進行，三電極體系：GCE為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極；電位掃描范圍為0.2 V至1.2 V，掃描速率為100 mV/s。所有檢測均在室溫下進行。記錄將傳感器浸泡在乙酸-乙醇=9∶1(V/V)的溶液中洗脫一定時間后的ECL信號，然后在一定濃度的目標分子PRO溶液中進行培養(yǎng)，再次記錄信號值，通過建立信號差值與PRO溶液濃度的定量關系，實現(xiàn)對PRO的分析檢測。

2 結果與討論

2.1 RuSi@PEI NPs的形貌表征

圖2(a)和2(b)分別為RuSi@PEI NPs的透射電鏡(TEM)圖和掃描電鏡(SEM)圖。從圖中可以看出，RuSi@PEI NPs分散性好，平均粒徑為60 nm左右。RuSi NPs的表面明顯看到有PEI聚合物膜層的包裹，說明了復合納米粒子成功制備。

圖2 RuSi@PEI NPs的透射電鏡(TEM)圖(a)和掃描電鏡(SEM)圖(b)Fig.2 TEM image(a) and SEM image(b) of RuSi@PEI NPs

2.2 RuSi@PEI NPs的光學性能表征

圖3 RuSi NPs和RuSi@PEI NPs的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra of RuSi NPs and RuSi@PEI NPs

圖4為不同材料的ECL信號的對比圖。圖中曲線a為RuSi/GCE在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中的ECL曲線，從圖中可以看出其ECL信號較弱；當反應底液為含有20%PEI的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)時，溶液中的PEI作為共反應劑參與修飾在電極上的RuSi NPs ECL過程，使得ECL強度明顯增大(曲線b)；當電極表面的修飾物為RuSi@PEI時，其在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中的ECL信號強度最大(曲線c)，說明納米材料的復合，使發(fā)光體與共反應劑之間的電子轉移距離更短，轉移效率更高，ECL效率更高，故而表現(xiàn)出優(yōu)異的ECL性能。

圖4 (a)RuSi/GCE在0.1 mol/L PBS中的ECL響應；(b)RuSi/GCE在含20%PEI的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中ECL響應；(c)RuSi@PEI/GCE在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中ECL響應。電位：0.2～1.2 VFig.4 (a)ECL responses of RuSi/GCE in 0.1 mol/L PBS;(b) ECL responses RuSi/GCE in 0.1 mol/L PBS(pH=7.0) containing of 20% PEI;(c) ECL responses of RuSi@PEI/GCE in 0.1 mol/L PBS(pH=7.0)Scan rate:100 mV/s;Scan potential:0.2-1.2 V.

2.3 傳感器對PRO的識別與條件優(yōu)化

圖5為PRO印跡的ECL傳感器的ECL圖。將含有模板分子PRO的聚合物膜修飾在RuSi@PEI NPs表面，在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中測量其ECL信號，強度趨近于0，這是因為致密的聚合物膜導電性較差，阻斷了電子傳輸過程。將該電極置于乙酸-乙醇=9∶1(V/V)的洗脫液中除去模板分子PRO后，聚合物膜表面形成具有特定記憶結合位點的孔穴結構，為電子傳輸提供了通道，使得該傳感器的ECL信號增大。當洗脫后的傳感器在PRO溶液中培養(yǎng)一段時間后，PRO重新填充了部分孔穴，導致ECL信號值減小。

圖5 MIP/RuSi@PEI/GCE的ECL曲線圖。(a)洗脫前；(b)洗脫后；(c)再培養(yǎng)Fig.5 ECL curves of MIP/RuSi@PEI/GCE.(a) before elution;(b) after elution;(c) after re-incubation

為了得到最佳ECL性能的RuSi@PEI NPs，對PEI與RuSi NPs的體積比行了優(yōu)化(圖6)。取300 μL的RuSi NPs溶液，分別與100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL 20%的PEI反應。隨著PEI用量的增大，促進RuSi NPs ECL的共反應劑就越多，相應的ECL強度也增大；當PEI達到300 μL時，ECL強度達到最大，繼續(xù)增加PEI的用量ECL信號反而減小，可能此時RuSi NPs的共反應劑已經飽和而增加PEI的用量不會增強ECL信號，并且過量的PEI會使RuSi NPs表面的PEI膜增厚從而造成ECL信號減小。因此本實驗選擇RuSi NPs與PEI的體積比為1∶1作為最優(yōu)比例。

圖6 RuSi@PEI NPs合成中RuSi NPs和PEI體積比的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the volume of RuSi NPs and PEI in the synthesis of RuSi@PEI NPs

實驗對分子印跡RuSi@PEI/GCE傳感器的洗脫及孵育時間進行了優(yōu)化。將印跡后的電極浸入洗脫液乙酸-乙醇=9∶1(V/V)中洗去模板分子PRO，隨著洗脫時間的延長，該傳感器的ECL信號逐漸增大，當洗脫時間達到8 min時，信號到達最大值(圖7(a))；繼續(xù)延長洗脫時間，ECL強度基本保持不變，表明8 min 時模板分子洗脫量達到最大，選擇其為最佳的洗脫時間。

移除模板分子后，將該MIP-ECL傳感器在1.0×10-9mol/L的PRO溶液中培養(yǎng)，在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中測定其ECL強度的變化，從圖7(b)中可觀察到，隨著培養(yǎng)時間的增大，該傳感器的ECL信號逐漸減小，這是因為越來越多的模板分子進入孔穴中，阻礙了電子傳輸，因此ECL信號變小。當培養(yǎng)時間為6 min時，ECL強度達到最小值，繼續(xù)增加培養(yǎng)時間，其強度無明顯變化，表明模板分子PRO在孔穴中達到印跡平衡，因此6 min被選作為最優(yōu)培養(yǎng)時間。

圖7 (a)MIP-ECL傳感器洗脫時間的優(yōu)化；(b)MIP-ECL傳感器的孵育時間優(yōu)化Fig.7 (a)Optimization of the removing time of the MIP-ECL sensor;(b)Optimization of the incubating time of the MIP-ECL sensor

2.4 線性測定

在最佳實驗條件下，我們探究了ECL強度差值隨PRO濃度的變化關系。去除模板分子后，傳感器在不同濃度的PRO溶液(1.0×10-11mol/L，5.0×10-11mol/L，1.0×10-10mol/L，5.0×10-10mol/L，1.0×10-9mol/L，5.0×10-9mol/L)中培養(yǎng)。實驗結果如圖8，傳感器在PRO溶液中培養(yǎng)前后的ECL峰強度的差值隨PRO濃度的增大而增大，其差值ΔIECL與PRO濃度的對數(shù)值在1.0×10-11mol/L到5.0×10-9mol/L范圍內呈現(xiàn)出良好的線性相關性，線性回歸方程為:ΔIECL=811.7lgc+3059，R2=0.993，檢測限(S/N=3)為5.4×10-13mol/L。

圖8 (a)不同濃度PRO的ECL信號(a～f:1.0×10-11 mol/L，5.0×10-11 mol/L，1.0×10-10 mol/L，5.0×10-10 mol/L，1.0×10-9 mol/L，5.0×10-9 mol/L);(b)PRO的標準曲線(誤差棒代表標準偏差，n≥3)Fig.8 (a) ECL signals to different concentrations of PRO (a-f:1.0×10-11 mol/L,5.0×10-11 mol/L,1.0×10-10 mol/L,5.0×10-10 mol/L,1.0×10-9 mol/L,5.0×10-9 mol/L);(b) Calibration curve for PRO determination(Error bars represent standard deviations,n≥3)

2.5 RuSi@PEI MIP-ECL傳感器的選擇性和穩(wěn)定性評估

選取PRO的類似物阿替洛爾、非諾特羅、奧西那林、美托洛爾作為干擾物進行選擇性實驗，1.0×10-9mol/L的PRO溶液中分別添加10倍于目標物濃度的不同干擾物，混合均勻。在最優(yōu)實驗條件下，檢測對應不同干擾物孵育的傳感器的ECL信號值。如圖9所示，上述4種過量的干擾物沒有引起ECL信號的顯著變化。這也說明了制備的MIP-ECL傳感器對PRO有出色的選擇性，這種良好的選擇性是由于分子印跡膜中存在與PRO分子有特異性識別位點的孔穴。

圖9 MIP-ECL傳感器的選擇性Fig.9 Specificity of the MIP-ECL sensorFrom 1 to 5:1.0×10-9 mol/L PRO,1.0×10-8 mol/L atenolol+1.0×10-9 mol/L PRO,1.0×10-8 mol/L fenoterol+1.0×10-9 mol/L PRO,1.0×10-8 mol/L metaproterenol+1.0×10-9 mol/L PRO,1.0×10-8 mol/L metoprolol+1.0×10-9 mol/L PRO

本實驗通過同一電極在連續(xù)10圈循環(huán)電勢掃描下的ECL強度來測定該傳感器的穩(wěn)定性(圖10)。MIP-ECL傳感器在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中掃描10個連續(xù)的ECL信號峰，無明顯差異，說明該傳感器有良好的穩(wěn)定性。

圖10 在連續(xù)循環(huán)電勢掃描10個循環(huán)下MIP-ECL傳感器的穩(wěn)定性Fig.10 Stability of MIP-ECL sensor under a continuous cyclic potential scan for 10 cycles

2.6 實際樣品檢測

選擇人血清作為實際樣品進行目標物加標回收實驗。取人血清在12 000 r/min的轉速下離心10 min，取1 mL上層清液，再加入100 mL水稀釋，向稀釋后的人血清中加入PRO配制成3種不同濃度(0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L)的溶液。測試結果如表1所示，PRO在人血清中的加標回收率分別為112.7%、93.8%、100.9%，相對標準偏差分別為2.3%、0.99%、7.9%。這表明該MIP-ECL傳感器在臨床樣品的檢測中表現(xiàn)良好，具有優(yōu)良的檢測性能，和潛在的分析應用價值。

表1 MIP-ECL傳感器檢測人血清樣品中的普萘洛爾Table 1 Detection of PRO in Human serum samples by the MIP-ECL sensor

3 結論

本文以PEI作為共反應劑與RuSi NPs通過靜電吸附結合形成RuSi@PEI NPs，并與分子印跡技術結合構建了MIP-ECL生物傳感器，實現(xiàn)對β-受體阻滯劑PRO的高靈敏檢測。RuSi@PEI的納米復合結構提高了電子傳輸效率，增大了ECL信號；MIPs表現(xiàn)出對PRO較好的特異性識別能力，增強了傳感器的選擇性。在最優(yōu)實驗條件下，PRO在1.0×10-11～5.0×10-9mol/L范圍內具有良好的響應，檢測限(S/N=3)為5.4×10-13mol/L。PRO印跡的ECL傳感器具有良好的穩(wěn)定性、選擇性、抗干擾能力和較寬的線性范圍，可用于實際樣品的檢測，在臨床分析中具有潛在的應用價值。