董辰博，李福才，董朝青，蔡 萍*，任吉存*

(1.上海交通大學(xué)電子信息與電氣工程學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 200240)

熒光相關(guān)光譜(Fluorescence Correlation Spectroscopy，F(xiàn)CS)是通過測(cè)定極小檢測(cè)微區(qū)內(nèi)熒光分子因布朗運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)漲落，并對(duì)漲落信號(hào)進(jìn)行相關(guān)函數(shù)統(tǒng)計(jì)分析后，從而獲得熒光相關(guān)光譜曲線的一種單分子光譜方法[1]?；趯?duì)一路漲落信號(hào)的自相關(guān)分析、兩路漲落信號(hào)間的互相關(guān)分析及三路漲落信號(hào)間的多元相關(guān)分析，熒光相關(guān)光譜可以分為自相關(guān)光譜(FACS)、互相關(guān)光譜(FCCS)和三元相關(guān)光譜(FTCS)等[2-7]。

上世紀(jì)70年代，Magde、Elson和Webb等人提出了FCS概念和理論，但由于當(dāng)時(shí)檢測(cè)技術(shù)的限制，F(xiàn)CS方法發(fā)展非常緩慢。1993年，Rigler等人將激光共聚焦技術(shù)引入FCS系統(tǒng)，顯著地減小了FCS檢測(cè)體積，極大地提高了FCS檢測(cè)的信噪比，真正實(shí)現(xiàn)了單分子檢測(cè)的目標(biāo)。目前，熒光相關(guān)光譜被廣泛地用于活細(xì)胞內(nèi)生物分子的濃度、擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)、酶的活性及分子相互作用研究，被認(rèn)為是活細(xì)胞原位研究的重要手段之一。國(guó)際上著名的光學(xué)顯微成像公司如蔡司、徠卡及奧林帕斯等公司均推出了相應(yīng)FCS儀器。遺憾的是目前國(guó)內(nèi)還沒有具有細(xì)胞掃描成像-熒光互相關(guān)光譜分析功能的國(guó)產(chǎn)儀器。

近二十年來(lái)，我們課題組一直從事于在熒光相關(guān)光譜的理論、方法和應(yīng)用研究工作[3,4,8-12]。本文基于我們?cè)跓晒庀嚓P(guān)光譜研究中獲得的某些關(guān)鍵技術(shù)，研制了一套細(xì)胞掃描成像-熒光互相關(guān)光譜聯(lián)用系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有高分辨活細(xì)胞成像和原位分析功能。進(jìn)而，我們將該系統(tǒng)成功地用于活細(xì)胞內(nèi)抑癌蛋白p53與MDMX蛋白相互作用的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

二維振鏡(GVS212，THORLABS，美國(guó))；數(shù)據(jù)采集卡(NI PCIe-6321,NI，美國(guó))；倒置顯微鏡(IX71，OLYMPUS，日本)；光子計(jì)數(shù)器(SPCM-AQRH-14，Excelitas，加拿大)；激光器(OBIS，Coherent，德國(guó))。

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640(高糖)、DMEM和小牛血清購(gòu)自美國(guó)Corning公司；RPMI 1640(無(wú)酚紅)、RPMI 1640(無(wú)糖)、Opti-MEM、Lipofectamine 2000、Penicillin-streptomycin sulphate、Trypsin-EDTA、Rhodamine green和Alexa Fluor 568 NHS購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Sodium pyruvate和2-deoxy-D-glucose購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞裂解液1×Glo lysis buffer購(gòu)自美國(guó)Promega公司；慢病毒載體EX-B0105-Lv122和EX-Z248-Lv155購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2購(gòu)自美國(guó)Addgene公司。DNA聚合酶KOD-Plus-NeO購(gòu)自TOYOBO生物公司。用于熒光相關(guān)光譜檢測(cè)的活細(xì)胞培養(yǎng)皿為蓋玻片底的培養(yǎng)皿(直徑30 mm)，底部厚度約為0.17 mm，購(gòu)自美國(guó)MatTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒載體選擇高保真DNA聚合酶KOD-Plus-NeO，以p53基因?yàn)槟０?，通過PCR擴(kuò)增目的基因。選擇BstBI和NotI作為雙酶切位點(diǎn)，對(duì)目的基因片段和目的質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切。將目的基因p53克隆到慢病毒表達(dá)載體EX-B0105-Lv122中，使p53與綠色熒光蛋白EGFP融合表達(dá)。選擇BstBI和NotI作為雙酶切位點(diǎn)，將目的基因MDMX克隆到慢病毒表達(dá)載體EX-Z248-Lv155中，使MDMX與紅色熒光蛋白mCherry融合表達(dá)。在已構(gòu)建好的p53質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，通過引物設(shè)計(jì)，在p53的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)突變；目的是獲得p53蛋白的L344P結(jié)構(gòu)域突變的質(zhì)粒，從而構(gòu)建出野生型p53和MDMX、突變型p53和MDMX兩種目的質(zhì)粒。

1.2.2 構(gòu)建細(xì)胞株以HEK293T細(xì)胞為宿主細(xì)胞，利用第二代慢病毒包裝的方法構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。取1.5 mL的離心管(管1)，先加入Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，然后加入1 μg目的質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒3 μg(psPAX2:.25 μg，pMD2.G:0.75 μg),使總體積為250 μL。取600 μL的離心管(管2)，加入240 μL的Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基和10 μL的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，室溫靜置5 min。將管2中的混合物加入到管1中，室溫靜置20 min。將管1中的復(fù)合物加入到HEK293T細(xì)胞中，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后收集病毒液。采用0.45 μm的濾膜對(duì)病毒液過濾。選擇H1299細(xì)胞(人源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞) 作為宿主細(xì)胞。將病毒液(200 μL) 滴加到H1299細(xì)胞中。利用含有1 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)p53-EGFP的H1299細(xì)胞進(jìn)行篩選；利用含有250 μg/mL G418的培養(yǎng)基對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)MDMX-mCherry的H1299細(xì)胞進(jìn)行篩選。從而獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)p53-EGFP和MDMX-mCherry的H1299細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用到的細(xì)胞為H1299和HEK293T(人源胚胎腎細(xì)胞)。H1299細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加10%FBS，1%雙抗(青霉素-鏈霉素)，1.5 g/L的NaHCO3，2.5 g/L葡萄糖和0.11 g/L丙酮酸鈉。HEK293T細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加10%FBS，1%雙抗。細(xì)胞培養(yǎng)條件：37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，CO2濃度為5%，并保持一定濕度。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析熒光自相關(guān)光譜(公式1)和互相關(guān)光譜(公式2)的三維自由擴(kuò)散數(shù)學(xué)模型用于在FCS數(shù)據(jù)處理，通過Origin軟件進(jìn)行非線性最小二乘擬合得到各參數(shù)值。

(1)

其中，N為檢測(cè)微區(qū)內(nèi)熒光分子數(shù)，T為處于熒光三線態(tài)的熒光分子比例，τtr為分子處于三線態(tài)的弛豫時(shí)間(μs)，τD為特征擴(kuò)散時(shí)間(ms)，ω和z分別是激光聚焦在XY方向和Z方向上的半徑(nm)。

(2)

其中，Veff為有效檢測(cè)體積，Cg和Cr分別為綠色和紅色檢測(cè)通道測(cè)得的兩種熒光分子濃度，Cgr為兩種熒光分子復(fù)合物的濃度，τD,gr為該復(fù)合物的特征擴(kuò)散時(shí)間。

(3)

其中，Ngr表示檢測(cè)微區(qū)內(nèi)的結(jié)合的熒光粒子，Ng分別表示檢測(cè)微區(qū)內(nèi)的綠色熒光粒子。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器硬件系統(tǒng)的研制

該儀器硬件系統(tǒng)設(shè)計(jì)方案如圖1所示。系統(tǒng)由掃描成像、熒光互相關(guān)光譜和倒置顯微鏡組成。目前掃描成像-熒光互相關(guān)光譜系統(tǒng)兼容在奧林帕斯公司IX71倒置顯微鏡底座上使用，調(diào)整后可兼容在其它公司倒置顯微鏡底座上使用。該系統(tǒng)采用連續(xù)固體激光器作為激發(fā)光源，將405 nm、488 nm、561 nm和640 nm四路激光通過合束器進(jìn)行合束。通過準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡擴(kuò)束，經(jīng)二維振鏡掃描系統(tǒng)的全反射鏡反射后，經(jīng)二色鏡反射進(jìn)入高數(shù)值孔徑的物鏡聚焦于樣品中。物鏡安裝在一個(gè)壓電陶瓷納米定位系統(tǒng)，控制物鏡Z向定位。樣品產(chǎn)生的熒光信號(hào)被同一物鏡收集，透過相同的二色鏡后，被另一個(gè)二色鏡和兩片帶通濾光片將熒光信號(hào)分成兩路檢測(cè)通道(綠光和紅光檢測(cè)通道)。最后，兩路熒光信號(hào)經(jīng)聚焦后分別被單光子計(jì)數(shù)器收集。獲得的數(shù)字信號(hào)由數(shù)字相關(guān)卡處理得到熒光相關(guān)曲線。三維掃描成像由掃描程序控制二維振鏡掃描系統(tǒng)、Z向納米定位系統(tǒng)和信號(hào)采集系統(tǒng)來(lái)完成。通過優(yōu)化光學(xué)構(gòu)型和光學(xué)元件的配置，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞三維成像和原位熒光相關(guān)光譜分析功能。其中，活細(xì)胞三維成像用于細(xì)胞定位，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞原位熒光相關(guān)光譜分析，從而獲取活細(xì)胞生物分子時(shí)空信息。

圖1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)方案Fig.1 The working scheme of the instrument

2.2 儀器軟件系統(tǒng)的研制

該軟件系統(tǒng)主要包括激光光路切換控制模塊、三維掃描控制模塊、數(shù)據(jù)采集和處理分析、數(shù)據(jù)波形顯示及存儲(chǔ)模塊等。該控制系統(tǒng)基于NI公司的數(shù)據(jù)采集卡(PCLe-6321)，采用Labview進(jìn)行開發(fā)，該系統(tǒng)工作原理如圖2所示。通過控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞三維成像和熒光相關(guān)光譜分析自動(dòng)化。

圖2 數(shù)據(jù)采集與控制系統(tǒng)Fig.2 Data acquisition and control system

圖3為系統(tǒng)軟件界面截圖，軟件系統(tǒng)設(shè)置了多個(gè)模塊來(lái)實(shí)現(xiàn)其主要功能：激光控制模塊區(qū)可以實(shí)現(xiàn)激光開關(guān)(Laser 1和Laser 2)和光強(qiáng)設(shè)置(Laser power)；三維掃描控制模塊區(qū)可實(shí)現(xiàn)二維掃描(Scanning)、三維定位(X、Ystep，Zstep)；FCS模塊區(qū)可實(shí)現(xiàn)分析通道選擇(Channels)、FCS工作模式選擇(Mode：auto和cross)、采樣時(shí)間設(shè)置(Sampling time)及數(shù)據(jù)保存(Save)等功能；工作模式中auto模式為自相關(guān)光譜，cross模式為互相關(guān)光譜。此外，能實(shí)時(shí)顯示熒光強(qiáng)度變化(Intensity A/B)及運(yùn)行時(shí)間(Elapsed time)。如圖3所示，顯示器能夠顯示細(xì)胞圖像、熒光強(qiáng)度軌跡及熒光相關(guān)光譜曲線等信息。

圖3 系統(tǒng)軟件界面截圖Fig.3 The software interface of the instrument

2.3 儀器功能的測(cè)試

我們首先對(duì)該系統(tǒng)的細(xì)胞成像功能和熒光相關(guān)光譜分析功能進(jìn)行測(cè)試。圖4為穩(wěn)定表達(dá)p53-EGFP和MDMX-mCherry蛋白的活細(xì)胞成像圖。從該圖中可以看出，通過控制物鏡在Z向的不同位置可以獲得不同位置的細(xì)胞光切片圖像。如圖4所示，p53-EGFP和MDMX-mCherry蛋白均勻地分布在細(xì)胞核中，圖中黑影位置應(yīng)為細(xì)胞核仁。以上結(jié)果表明該系統(tǒng)成功地用于活細(xì)胞的三維掃描成像，具有很高的分辨率。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)p53-EGFP和MDMX-mCherry的活細(xì)胞共聚焦掃描成像分析圖(Z位置)Fig.4 Confocal images of H1299 living cells expressing p53-EGFP and MDMX-mCherry(Z position)

圖5分別為兩種熒光染料Rhodamine green(綠光檢測(cè)通道)和Alexa Fluor 568(紅光檢測(cè)通道)的FCS曲線。采用公式(1)對(duì)FCS曲線進(jìn)行擬合，測(cè)得兩種染料分子在檢測(cè)微區(qū)內(nèi)分子數(shù)分別約為3.6和4.2，特征擴(kuò)散時(shí)間分別為27.6 μs和61.8 μs。通過計(jì)算，該系統(tǒng)聚焦檢測(cè)體積分別為0.3 fL和0.7 fL，結(jié)果表明該系統(tǒng)具有非常小的檢測(cè)體積，達(dá)到了光學(xué)衍射極限。

圖5 兩種染料熒光自相關(guān)光譜曲線。5.1 nmol/L Rhodamine green(A) 和6.1 nmol/L Alexa Fluor 568(B)的FCS曲線。488 nm激光激發(fā)強(qiáng)度為65微瓦，561 nm激光激發(fā)強(qiáng)度為95微瓦Fig.5 The auto-correlation and cross-correlation curves of Rhodamine green(A) and Alexa Fluor 568(B).The concentration of Rhodamine green and Alexa Fluor 568 is 5.1 nmol/L and 6.1 nmol/L,respectively.The laser intensity of 488 nm and 561 nm is 65 μW and 95 μW

2.4 活細(xì)胞內(nèi)p53和MDMX蛋白相互作用研究

p53蛋白是一種重要的抑癌因子，可以調(diào)控下游多種蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生理過程。MDMX是一種促癌蛋白，它能與p53結(jié)合從而抑制p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。因此，p53與MDMX的相互作用的研究對(duì)于癌癥的治療、抑制劑的開發(fā)具有重要的生物學(xué)意義。

我們將該系統(tǒng)用于活細(xì)胞內(nèi)p53和MDMX蛋白相互作用研究。首先獲取活細(xì)胞共焦掃描成像圖如圖3，通過軟件中三維定位(X、Ystep，Zstep)功能鍵將檢測(cè)坐標(biāo)(+)移到細(xì)胞中目標(biāo)位置后，從FCS模塊的Channels鍵選擇dual、Mode鍵選擇cross，并在Sampling time處輸入采樣時(shí)間，然后按FCS run鍵開始獲取該位置的兩路熒光自相關(guān)光譜和熒光互相關(guān)光譜曲線。在采樣結(jié)束后，保存獲得的數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析。

研究中，我們以互相關(guān)值CC(Cross-Correlation value)表示蛋白相互作用的強(qiáng)弱。CC值越大表示蛋白質(zhì)相互作用越強(qiáng)。通過慢病毒感染的方法構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)p53-EGFP和MDMX-mCherry的H1299細(xì)胞模型?；罴?xì)胞中p53和MDMX蛋白分別被綠色熒光蛋白(EGFP)和紅色熒光蛋白(mCherry)標(biāo)記。原位研究了活細(xì)胞內(nèi)野生型p53和突變型p53分別與MDMX蛋白相互作用,研究結(jié)果如圖6所示。圖6A中實(shí)線為野生型p53和MDMX蛋白的自相關(guān)和互相關(guān)曲線和擬合曲線，互相關(guān)對(duì)應(yīng)的CC值為55%，其擬合殘差小于0.01。圖6A結(jié)果表明兩種蛋白具有很強(qiáng)的互相作用。圖6B中實(shí)線為突變型p53和MDMX蛋白的自相關(guān)和互相關(guān)曲線，對(duì)應(yīng)的CC值僅為13%，擬合殘差小于0.01。圖6B中的CC值接近于陰性對(duì)照值，這是由于綠色熒光信號(hào)串入到紅色熒光通道(cross-talk)引起的。以上結(jié)果表明，野生型p53與MDMX蛋白的相互作用明顯的強(qiáng)于突變型p53(L344P)與MDMX的相互作用，這與胞外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。同時(shí)，研究結(jié)果表明我們構(gòu)建的FCCS系統(tǒng)適合于活細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用的研究。

圖6 p53和MDMX蛋白相互作用研究。(A)野生型p53-EGFP和MDMX-mCherry的自相關(guān)曲線、互相關(guān)曲線和擬合殘差;(B)突變型p53 L344P-EGFP和MDMX-mCherry的自相關(guān)曲線、互相關(guān)曲線和擬合殘差Fig.6 The interaction of p53-EGFP and MDMX-mCherry.(A) The auto-correlation and cross-correlation of p53-EGFP,MDMX-mCherry,and the corresponding fitting residuals;(B) The auto-correlation and cross-correlation of L344P-EGFP,MDMX-mCherry,and the corresponding fitting residuals

3 結(jié)論

本文研制了一套細(xì)胞掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子檢測(cè)系統(tǒng)，將該系統(tǒng)成功地用于活細(xì)胞內(nèi)p53和MDMX蛋白相互作用的研究，發(fā)現(xiàn)了p53的L344P結(jié)構(gòu)域?qū)53-MDMX蛋白相互作用起到關(guān)鍵性作用。該系統(tǒng)具有高分辨細(xì)胞成像、活細(xì)胞內(nèi)多組分原位分析等基本功能，在細(xì)胞生物學(xué)研究、化學(xué)生物學(xué)研究等領(lǐng)域具有極好的應(yīng)用前景。