厲 婷，徐加泉*，黃衛(wèi)華

(1.江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室，東華理工大學(xué)，江西南昌 330013；2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

電極污染是電化學(xué)分析中一個極其重要的問題，因此，提高電化學(xué)傳感界面的穩(wěn)定性，實現(xiàn)電化學(xué)傳感界面的無損更新，提高傳感器的使用壽命，將有利于提高分析結(jié)果準(zhǔn)確度以及降低分析成本。目前，解決電極污染的策略有兩種：一種是提高電極的抗污染性能；另一種是通過物理或化學(xué)的方法去除電極表面的污染物。第一種方法可以有效延長電極單次使用壽命，適用于需要進(jìn)行長時間電化學(xué)監(jiān)測的體系，比如細(xì)胞的長時間監(jiān)測；而第二種方法可以提高電極重復(fù)使用次數(shù)，提高電極重復(fù)使用率，不僅可以有效降低分析成本，而且在進(jìn)行重復(fù)實驗或?qū)φ諏嶒灂r，有利于保持分析條件的一致性，提高結(jié)果準(zhǔn)確度。因此，結(jié)合這兩種方法的優(yōu)點，發(fā)展一種具有抗污染性能的可更新電極，對于電化學(xué)分析具有重要意義。在前期研究中，我們發(fā)展了一種基于光催化納米材料(TiO2、ZnO等)和電化學(xué)傳感材料(Au納米顆粒、石墨烯等)的光致清潔可更新電極[1,2]，可通過光催化劑的光催化降解作用，除去電極表面的污染物，在保持電極表面結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的前提下，實現(xiàn)修飾電極的無損、高效更新。但不足的是，Au納米顆粒作為一種高性能電化學(xué)傳感材料，雖然可以提供良好的電化學(xué)性能，但同時非常容易與生物分子中的-NH2、-SH等基團(tuán)發(fā)生配位作用，導(dǎo)致生物分子吸附在電極表面[3-5]，降低Au電極電化學(xué)性能，縮短電極單次使用壽命。而在細(xì)胞長期培養(yǎng)或體內(nèi)檢測過程中，由于電極需要與生物體系長時間的接觸，如果電極抗污染性能較差，則在細(xì)胞培養(yǎng)后期，電極活性將大大降低[6,7]，失去在線分析檢測能力。因此，我們希望在實現(xiàn)電極有效更新的基礎(chǔ)上，能提高電極抗污染性能。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，摻硼金剛石[8]、碳納米管(CNTs)[9,10]、聚3,4-乙烯二氧噻吩(PEDOT)[6,11]、聚吡咯(PPy)[12]等電極材料均具有較好的抗污染能力。而從材料加工、制備、修飾、傳感性能等方面考慮，CNTs、PEDOT、PPy具有較強(qiáng)優(yōu)勢。例如采用濕法紡絲，可制備出不同形狀的CNTs纖維[13]，CNTs管纖維電極不僅具有良好的電化學(xué)性能，而且具有很強(qiáng)的抗多巴胺污染能力[9]。Heien等人則在碳纖維電極表面電聚合修飾PEDOT∶PSS，與單純碳纖維電極相比，PEDOT∶PSS修飾后的電極在生物體系中的抗污染性能大大增強(qiáng)[6]。因此，為了在可更新性能基礎(chǔ)上，進(jìn)一步獲得良好抗污染性能，可將抗污染電極材料與光催化劑進(jìn)行復(fù)合，構(gòu)建一種具有抗污染能力的可更新電極，其中抗污染電極材料可提供電極抗污染性能及電化學(xué)性能，而光催化劑則提供電極可更新性能。

一維(1D)導(dǎo)電纖維由于可用于構(gòu)建柔性傳感器、微電極等而備受關(guān)注[14-16]。目前常用的1D導(dǎo)電纖維有金屬線(Au、Pt)[17]、碳纖維[18]、CNTs纖維[13]、PEDOT纖維[19,20]等。常用的制備纖維的方法有紡絲法[13,19,21]、化學(xué)合成[22]等，但大規(guī)模簡便、可控的制備1D導(dǎo)電纖維仍具有一定的挑戰(zhàn)。2015年，Wu等人報道了一種直接書寫制備超長超細(xì)CNTs纖維的方法[23]，為方便快速制備導(dǎo)電纖維提供了一種良好的思路，但由于其采用了易溶于水的聚環(huán)氧乙烷(PEO)作為膠連材料，導(dǎo)致纖維在水中容易被破壞，因而難以用于制作電化學(xué)傳感器?；诖耍疚陌l(fā)展了一種直接拉絲制備PEDOT/CNTs/TiO2導(dǎo)電纖維的方法。將PVP、CNTs、TiO2加入到PEDOT∶PSS溶液中，制得高粘彈性溶液，然后通過直接拉絲法(圖1)，便可簡單、快速地制備出超長PEDOT/CNTs/TiO2導(dǎo)電纖維，其長度可達(dá)10 cm，直徑可低至3 μm。在此基礎(chǔ)上，研制出PEDOT/CNTs/TiO2平面纖維電極以及單根纖維電極，所得電極表現(xiàn)出良好的抗污染性能、電化學(xué)性能及較好的光致清潔性能，并成功應(yīng)用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)NO釋放檢測。

圖1 復(fù)合纖維制造過程示意圖Fig.1 A schematic diagram of the manufacturing procedur of composite fiber

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

電化學(xué)工作站(CHI 660a，上海辰華儀器公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heracell 150i，Thermo Scientific，美國)；多功能全自動倒置熒光顯微鏡(AxioObserver Z1，Zeiss公司，德國)；潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；自動高壓滅菌鍋(SYQ-DSX-280B型，上海申安醫(yī)療器械廠)；超聲波清洗機(jī)(KQ350，昆山市超聲儀器有限公司)；流動注射泵TS-2A(保定蘭格恒流泵有限公司)；電熱烘箱(DHG-9140A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；超純水儀(18.2 MΩ，Millipore)；高壓汞燈(1 000 W，主波長365 nm，光強(qiáng)度12 mW/cm2)；勻膠機(jī)(KW-4A，北京鑫有研電子科技有限公司)；光刻機(jī)(G17，成都鑫南光機(jī)械設(shè)備有限公司)；等離子體清洗器(Harrick Scientific，Ossining，NY，美國)。

TiO2(P25，德國贏創(chuàng)德固賽公司)，碳納米管(南京先鋒納米公司)，PEDOT/PSS溶液(Clevios TM PH1000，德國Heraeus公司)，導(dǎo)電膠(英國Bare conductive公司)，SU-8系列負(fù)光刻膠及負(fù)膠顯影液(MicroChem Corp.Newtown，MA)，聚二甲基硅氧烷預(yù)聚體及交聯(lián)劑(Momentive Performance Materials，Waterford，NY，美國)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、丙酮、無水乙醇、NaNO2、H2SO4、NaCH、KMnO4、NaHCO3、Triton X-100(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯氰(PAN)、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、L-精氨酸(L-Arg、NOS抑制劑Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride(L-NAME)購于Sigma公司(上海)，鈣黃綠素(Calcein，CAM)及死細(xì)胞染色試劑碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)購于Dojindo laboratory(美國)，細(xì)胞培養(yǎng)RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清購于GIBCO(美國)公司，谷氨酰胺、HEPES和胰蛋白酶購自美國Amresco公司，青霉素、鏈霉素購自武漢中南醫(yī)院，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購于CHI Scientific，Inc(上海)。實驗中所用試劑，無特殊說明外均無進(jìn)一步純化。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶液：稱取8 g NaCl，0.2 g KCl，3.63 g Na2HPO4·12H2O，0.24 g KH2PO4，溶于1 L滅菌的超純水中，溶解完全后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4左右，并用200 nmol/L孔徑的濾頭過濾。NO的PBS飽和溶液[24,25]：首先往反應(yīng)體系中鼓入N2，以除去體系中的空氣，然后關(guān)閉N2，通過恒壓滴液漏斗，往50 mL 4 mol/L NaNO2溶液中逐滴加入25 mL 的2 mol/L H2SO4，反應(yīng)生成NO及NO2，將產(chǎn)生的氣體通過NaOH溶液，除去混合氣中的NO2，純化后的NO通入PBS(5 mL)，直至形成飽和溶液，根據(jù)文獻(xiàn)報道[24,25]，所得NO飽和溶液的濃度為1.8 mmol/L。HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)基：87 mL RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+12 mL胎牛血清+0.4776 g HEPES+0.0292 g谷氨酰胺+0.085 g NaHCO3+1 mL雙抗(100 U/mL青霉素，鏈霉素)，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.2～7.4，并用200 nmol/L孔徑的濾頭過濾，然后于4 ℃保存。細(xì)胞消化液：0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA的PBS。所有與細(xì)胞相關(guān)的溶液均用滅菌超純水配制，用2 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至7.2，經(jīng)0.2 μm孔徑過濾膜除菌，并密封保存在4 ℃冰箱里。

1.2.2 導(dǎo)電復(fù)合纖維的制備復(fù)合溶液的配制：取1 mL PEDOT∶PSS溶液，加入50 μL DMSO，混合均勻后，依次加入5 mg TiO2、10 mg CNTs、20 mg PVP，攪拌均勻后加入200 μL Triton X-100，再次攪拌后，獲得深藍(lán)色粘稠液體，于4 ℃下保存。復(fù)合纖維的制備：取一根毛細(xì)管，蘸取少量復(fù)合溶液，通過簡單拉制，便可形成一根纖維，隨著纖維中溶劑的揮發(fā)，纖維逐漸變細(xì)，最終獲得穩(wěn)定的PVP/PEDOT/CNTs/TiO2復(fù)合纖維，將該纖維于120 ℃下加熱20 min，然后置于DMF中10 min，以除去復(fù)合纖維中的PVP，然后再次干燥后便可獲得PEDOT/CNTs/TiO2導(dǎo)電纖維。見圖1。

1.2.3 基于復(fù)合導(dǎo)電纖維電極的制備平面纖維電極：將制得的導(dǎo)電復(fù)合纖維置于玻璃片上，用PDMS進(jìn)行固定及絕緣，制備出約4 mm長的導(dǎo)電復(fù)合微米線電極，并以導(dǎo)電碳膠及銅絲進(jìn)行連接。單根纖維電極：微米纖維電極的制備如圖2所示。(1)用拉制儀拉制出具有微米級尖端的玻璃管。(2)將玻璃管表面進(jìn)行鍍金處理，并將玻璃管尖端的金層用王水溶解。(3)將復(fù)合纖維貼于玻璃管表面，用手術(shù)刀切割以獲得所需長度的電極尖端，并用PDMS進(jìn)行絕緣。(4)將制備好的電極于加熱臺上120 ℃加熱20 min，然后浸入DMF中溶解復(fù)合纖維中的PVP，加熱干燥后，獲得基于PEDOT/CNTs/TiO2導(dǎo)電纖維的微電極?；谖⒘骺匦酒奈㈦姌O：將導(dǎo)電復(fù)合纖維置于潔凈載玻片上，用Plasma處理2 min后，與一個“一”字形通道的PDMS芯片鍵合，制得基于微流控芯片的微電極。

圖2 復(fù)合導(dǎo)電纖維微電極制作流程示意圖Fig.2 A schematic diagram of the fabrication process of composite conduction fiber microelectrode

1.2.4 濕法紡絲及氣相沉積制備PEDOT復(fù)合纖維濕法紡絲的制備：首先在1 mL PEDOT/PSS溶液中加入50 μL DMSO，以提高PEDOT/PSS的導(dǎo)電性和電化學(xué)性能[26]。然后加入10 mg CNTs和5 mg TiO2NPs，超聲分散后，經(jīng)尖端直徑20 μm拉制玻璃管，用1 mL注射器，以1 μm/min的流速，注入到丙酮溶液中，在丙酮溶液底部放置一玻璃基底，便可在玻璃基底表面獲得PEDOT/CNTs/TiO2復(fù)合纖維，并用以構(gòu)建電極。氣相沉積法制備復(fù)合纖維[20]：在1 mL DMF中，依次加入70 mg PAN、10 mg CNTs、5 mg TiO2，攪拌均勻后通過靜電紡絲，在玻璃基底表面制得PAN復(fù)合纖維，然后通過旋涂FeCl3的乙醇溶液，在纖維表面涂覆一層FeCl3。以EDOT為原料，通過氣相沉積法在PAN復(fù)合纖維表面聚合形成PEDOT薄膜，然后將該基底浸泡于DMF溶液中，除去復(fù)合纖維中的PAN，制得PEDOT/CNTs/TiO2復(fù)合纖維。

1.2.5 電極抗污染性能及可更新性能的表征電極抗污染性能的表征：以細(xì)胞培養(yǎng)基作為介質(zhì)，考察電極的穩(wěn)定性和可更新性能。將電極置于HUVECs細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液中，定時檢查電極對K3[Fe(CN)6]的響應(yīng)，以評估電極的抗污染性能。電極可更新性能的表征：將電極浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后施加+0.6 V的電壓，以促進(jìn)培養(yǎng)基對電極的污染毒化作用。電極污染毒化后，將電極用水沖洗后置于水中，用紫外光進(jìn)行活化更新，以K3[Fe(CN)6]作為探針分子，通過比較毒化前及活化后K3[Fe(CN)6]的響應(yīng)，評估電極的可更新性能。

1.2.6 細(xì)胞的培養(yǎng)及檢測首先，將HUVECs培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出，加入2 mL消化液孵育3～4 min，除去消化液后，加入培養(yǎng)基并吹打，形成細(xì)胞懸浮液。然后取50 μL細(xì)胞懸浮液滴加到已紫外滅菌的平面纖維電極表面(用PDMS在電極表面圍成一個4 mm×4 mm的儲液池，電極尺寸為長4 mm，直徑5 μm)，并置于培養(yǎng)箱中(37 ℃，5%CO2)培養(yǎng)12 h。檢測時，將電極取出，除去電極表面的培養(yǎng)基，加入PBS，然后施加+0.85 V的恒電位，電極極化平衡后，加入5 μL 10 mmol/L L-Arg的PBS，刺激細(xì)胞釋放NO[27]，并通過電化學(xué)方法進(jìn)行檢測。

1.2.7 表征方法及儀器采用FE-SEM(德國Zeiss公司)進(jìn)行材料形貌表征；掃描電子顯微鏡(SEM-EDX，Quanta 200，荷蘭FEI公司)進(jìn)行能譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合導(dǎo)電纖維的制備

為了獲得高性能的復(fù)合纖維，我們選用了PVP、PEDOT/PSS、CNTs、TiO2作為原料。其中PVP作為一種高分子量(Mw=1 300 000)聚合物，具有很高的粘度，且易溶于水，便于操作，在本文中用作纖維模板；PEDOT/PSS作為一種優(yōu)良的電化學(xué)傳感材料，具有導(dǎo)電性能好，電催化活性高，抗生物污染強(qiáng)等優(yōu)點[6,11]；CNTs不僅可以提高復(fù)合纖維的電化學(xué)性能[28]，而且還可以增強(qiáng)復(fù)合纖維的機(jī)械性能[29,30]；TiO2作為一種優(yōu)秀的光催化劑[31]，在本文中為復(fù)合纖維提供光致清潔性能。實驗過程中，將所有原料混合均勻后，可獲得如圖3a所示的深藍(lán)色溶液，該溶液具有較高的粘度。值得注意的是，若將PEDOT/PSS溶液換成超純水，用以溶解分散PVP、CNTs及TiO2，則獲得低粘度的混合溶液(圖3b)。導(dǎo)致PVP與PEDOT/PSS混合溶液粘度增加的原因很有可能是PVP與PEDOT/PSS之間的作用力。根據(jù)文獻(xiàn)報道[32]，當(dāng)PEDOT/PSS溶液中含有2%的氧化石墨時，可獲得非常粘稠的膠狀物質(zhì)，完全失去了流動性，而這一現(xiàn)象的原因為PEDOT/PSS與氧化石墨烯之間存在較強(qiáng)的π-π作用。

圖3 兩種復(fù)合溶液的照片。(a)PVP/CNTs/TiO2分散在PEDOT/PSS溶液中；(b)PVP/CNTs/TiO2分散在超純水中Fig.3 Photograph of two kind of composite solution.(a) PVP/CNTs/TiO2 dispersed in PEDOT/PSS solution;(b) PVP/CNTs/TiO2 dispersed in ultrawater

為了獲得超長的復(fù)合纖維，可在配制的混合溶液中加入一定量Triton X-100溶液，其主要作用為降低溶液的表面張力，防止在拉制過程中纖維由于表面張力而斷裂[23]。此外，Triton X-100還可提高PEDOT/PSS的導(dǎo)電性及電化學(xué)活性[33]。然后用一根毛細(xì)管通過圖4a所示方式進(jìn)行拉絲，從圖中可以看到，通過簡單的拉制，我們可以獲得較長的微米復(fù)合纖維，通過顯微鏡照片可看到，纖維直徑約為3 μm。將拉制后的復(fù)合纖維于120 ℃下熱處理20 min，便可獲得PVP/PEDOT/CNTs/TiO2復(fù)合纖維。

圖4 (a)直接拉制法制備復(fù)合纖維(圓圈標(biāo)記處為復(fù)合纖維)；(b)PVP/PEDOT/CNTs/TiO2復(fù)合纖維的顯微圖像(比例尺：10 μm)Fig.4 (a) Preparation of composite fiber by direct drawing method(composite fiber is marked in the circle);(b) Microscopy image of the PVP/PEDOT/CNTs/TiO2 composite fiber(Scale bar:10 μm)

將復(fù)合纖維浸入DMF，浸泡10 min后，取出干燥，便可除去復(fù)合纖維中的PVP，獲得PEDOT/CNTs/TiO2導(dǎo)電纖維。實驗中之所以選用DMF進(jìn)行溶解PVP，是因為DMF溶液對PVP具有較好的溶解性，而對PEDOT/PSS溶液溶解性較差，從而保證PVP在溶解的時候可以維持纖維結(jié)構(gòu)不被破壞。當(dāng)選用超純水用于溶解PVP時，則纖維容易受到破壞，得不到完整的纖維結(jié)構(gòu)。相比于PVP/PEDOT/CNTs/TiO2纖維光滑的表面(圖5a)，DMF處理后的纖維表面較為粗糙，可明顯看到存在團(tuán)聚TiO2納米顆粒(圖5c)，且纖維直徑明顯減小，表明PVP/PEDOT/CNTs/TiO2纖維中PVP被溶解。EDX結(jié)果表明(圖5b、5d)，DMF處理之后，纖維中Ti元素及S元素含量均增加，表明纖維表面TiO2含量和PEDOT含量增加，進(jìn)一步證明PVP/PEDOT/CNTs/TiO2纖維中PVP被溶解。

2.2 復(fù)合導(dǎo)電纖維電化學(xué)性能表征

根據(jù)實驗部分1.2.3的方法，制備出一個長4 mm，直徑5 μm的平面纖維電極，以K3[Fe(CN)6]為探針分子，考察了其電化學(xué)活性。如圖6a所示，K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰明顯，其氧化還原電位差為0.12 V。根據(jù)文獻(xiàn)報道通過濕法紡絲[19,29,30]或者以電紡絲為模板采用氣相沉積[20,34]，均可制備出PEDOT復(fù)合導(dǎo)電纖維。因此，根據(jù)文獻(xiàn)報道，分別采用濕法紡絲和氣相沉積制備了PEDOT/CNTs/TiO2復(fù)合纖維(見實驗部分)。圖6b、6c分別為濕法紡絲和氣相沉積所得PEDOT復(fù)合纖維的電化學(xué)性能。從結(jié)果可以看出，兩種方法制得的復(fù)合纖維電化學(xué)性能很差，對K3[Fe(CN)6]幾乎無響應(yīng)。因此，通過對比三種方法所得PEDOT復(fù)合纖維的電化學(xué)性能，可以發(fā)現(xiàn)本文發(fā)展的方法具有絕對優(yōu)勢，可制備高電化學(xué)性能的PEDOT復(fù)合纖維。

為了進(jìn)一步考察PEDOT復(fù)合纖維在細(xì)胞信號分子檢測中的應(yīng)用前景，我們以細(xì)胞信號分子NO為探針，通過循環(huán)伏安和恒電位法對電極電化學(xué)性能進(jìn)行了考察。如圖7a所示，NO在電極表面的氧化電位為+0.8 V，且具有較強(qiáng)的氧化電流，表明電極具有良好的電催化性能。進(jìn)一步通過安培法對電極檢出限及線性區(qū)間進(jìn)行表征，結(jié)果如圖7b和7c所示。當(dāng)NO濃度低至10 nmol/L時，仍可明顯看到NO的響應(yīng)信號，而且可以發(fā)現(xiàn)，電極對NO的具有非?？焖俚捻憫?yīng)，按信噪比(S/N=3)計算可得電極對NO的檢測限為3 nmol/L，線性范圍為10～500 nm。

圖7 PEDOT/CNT/TiO2纖維電極對NO的循環(huán)伏安(CV)圖(a)、I-t曲線(b)和NO的校準(zhǔn)曲線(c)Fig.7 CV (a),I-t curves (b) and calibration curves (c) of PEDOT/CNTs/TiO2 fiber electrode to NO

2.3 復(fù)合導(dǎo)電纖維抗污染性能表征

PEODT可降低生物分子在電極表面的吸附，從而提高電極的抗污染性能[6,11]。因此，我們將PEDOT復(fù)合纖維電極與Au線電極(直徑25 μm，長3 mm)進(jìn)行比較，以評估PEDOT復(fù)合纖維電極的抗污染性能。實驗中，我們將PEDOT復(fù)合纖維電極與Au線電極同時浸泡于HUVECs完全培養(yǎng)基中，以K3[Fe(CN)6] 作為探針分子，考察浸泡不同時間后電極的性能，結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出，PEDOT復(fù)合纖維電極在培養(yǎng)基中浸泡34 h后，其電化學(xué)性能基本無變化，對K3[Fe(CN)6]仍表現(xiàn)出良好的電化學(xué)響應(yīng)。而Au線電極在經(jīng)過7 h浸泡后，電化學(xué)性能已有所降低，當(dāng)浸泡時間延長到22 h時，其電化學(xué)性能基本喪失，對K3[Fe(CN)6]已無電化學(xué)響應(yīng)。實驗結(jié)果表明PEDOT復(fù)合纖維電極具有良好的穩(wěn)定性和抗污染性能。

圖8 PEDOT/CNTs/TiO2纖維電極(a)和金線電極(b)在不同時間的細(xì)胞培養(yǎng)液中對K3[Fe(CN)6]的響應(yīng)。黑色(0 h)、紅色(7 h)、藍(lán)色(22 h)和綠色(34 h)Fig.8 The response of PEDOT/CNTs/TiO2 fiber electrode (a) and gold wire electrode (b) to K3[Fe(CN)6] after immersed in cell culture medium with different duration.Black (0 h),red (7 h),blue (22 h) and green (34 h)

2.4 復(fù)合導(dǎo)電纖維可更新性能表征

在細(xì)胞信號分子檢測過程中，信號分子在電極表面氧化還原產(chǎn)生的非電活性產(chǎn)物、細(xì)胞釋放的蛋白、培養(yǎng)液中的生物分子等都會對電極造成污染，降低活性。因此，在延長電極單次使用壽命的同時，我們希望電極具有較好的可更新性能，以實現(xiàn)電極重復(fù)使用。我們選用細(xì)胞培養(yǎng)基作為介質(zhì)用于考察電極的更新性能，因為培養(yǎng)基是電極用于細(xì)胞培養(yǎng)檢測過程中最常涉及到的物質(zhì)。首先，我們將電極浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后施加+0.6 V的電位，以促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基溶液對電極的污染作用。從圖9可以看出，電極經(jīng)培養(yǎng)基毒化后，其對K3[Fe(CN)6]已無響應(yīng)(紅線)。然后將該毒化后的電極置于超純水中，于紫外光下照射30 min進(jìn)行電極的更新。結(jié)果表明，活化后的電極其對K3[Fe(CN)6]已有明顯響應(yīng)，但電化學(xué)性能仍未恢復(fù)到初始狀態(tài)，僅為初始狀態(tài)的30%，表明該電極雖有一定的光致清潔能力，但仍有待提高。

圖9 PEDOT/CNTs/TiO2纖維電極在1 mol/L KCl的1 mmol/L K3[Fe(CN)6]中，于污染前(黑色)、污染后(紅色)和紫外線(藍(lán)色)下光催化清潔后的循環(huán)伏安(CV)圖Fig.9 CV of 1 mmol/L K3[Fe(CN)6] in 1 mol/L KCl on PEDOT/CNTs/TiO2 fiber electrode before fouling (black),after fouling (red) and after photocatalysis-induced cleaning under UV (blue)

由于PEDOT及CNTs良好的導(dǎo)電性，與TiO2復(fù)合后均可提高TiO2的光催化性[35,36]。而本文中復(fù)合纖維電極卻表現(xiàn)出較低的光催化性能，根據(jù)電鏡結(jié)果分析，導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能為復(fù)合纖維表面TiO2NPs的暴露量較少，大部分TiO2NPs被PEDOT包裹，阻礙了TiO2NPs的紫外吸收，導(dǎo)致其光催化性能降低。因此，后期仍需對纖維電極的制作過程進(jìn)行優(yōu)化，以提高復(fù)合纖維表面TiO2NPs的暴露量。

2.5 復(fù)合導(dǎo)電纖維用于細(xì)胞培養(yǎng)及NO釋放檢測

將制備好的PEDOT復(fù)合纖維電極置于操作臺上，紫外滅菌12 h，然后滴加HUVECs于電極表面(4 mm×4 mm儲液池)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。鈣黃綠素-PI染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)12 h培養(yǎng)后，可完全被鈣黃綠素染色(圖10a～c)，表明細(xì)胞活性良好。檢測前，將細(xì)胞表面培養(yǎng)基移除，加入60 μL PBS，以恒電位方式進(jìn)行細(xì)胞NO釋放檢測。實驗過程中，電位設(shè)置為+0.85 V，略高于NO在電極表面的氧化電位(+0.8 V)，以提高NO分子在電極表面的氧化速率。當(dāng)電極極化穩(wěn)定后，加入10 μL 10 mmol/L的L-Arg 溶液，刺激細(xì)胞產(chǎn)生NO分子[27]。從圖10d可以看出，加入L-Arg后出現(xiàn)明顯的電流信號峰，峰電流在10 s內(nèi)達(dá)到峰值，然后緩慢下降[37]。為了確定該電化學(xué)信號為細(xì)胞NO釋放所產(chǎn)生，我們在加入L-Arg 刺激之前，先在細(xì)胞溶液中加入10 μL 1 mmol/L的L-NAME，該物質(zhì)可通過抑制NO合成酶的活性以抑制NO的產(chǎn)生[38]，然后再加入L-Arg進(jìn)行刺激。從圖10d(紅線)可以看出，在抑制劑L-NAME的存在下，L-Arg不能誘導(dǎo)細(xì)胞釋放NO，證實圖10d(藍(lán)線)中電化學(xué)信號為NO，而且該實驗同時排除了L-Arg對信號的干擾。

圖10 在PEDOT/CNTs/TiO2纖維電極上培養(yǎng)12 h的HUVECs顯微圖像。(a)明場；(b)鈣黃綠素AM(綠色)和PI(紅色)染色；(c)亮場和熒光場的融合；(d)不同條件下PEDOT/CNTs/TiO2纖維電極對HUVECs釋放NO的安培響應(yīng)Fig.10 Microscopic images of HUVECs culture on PEDOT/CNTs/TiO2 fiber electrode for 12 h.(a) bright field;(b) stained by Calcein-AM (green) and PI (red);(c) merge of bright field and fluorescence field;(d) Amperometric response of PEDOT/CNTs/TiO2 fiber electrode toward NO release from HUVECs at different conditions

2.6 基于復(fù)合導(dǎo)電纖維的單根纖維電極

單根微米纖維電極由于其良好的操縱性能及高的時空分辨率，可用于單細(xì)胞的實時監(jiān)測。因此，本文采用一種簡單的制備方法(圖2)，制作了一種基于PEDOT的復(fù)合纖維的微電極。如圖11a所示，纖維電極直徑約為4 μm，其對K3[Fe(CN)6]的響應(yīng)如圖11b所示，K3[Fe(CN)6]在電極表面具有明顯的氧化還原峰，電位差為0.1 V，且循環(huán)伏安曲線表現(xiàn)出類“S”型，表明電極具有良好的電子轉(zhuǎn)移能力，有望用于單細(xì)胞水平的細(xì)胞信號分子檢測。

圖11 單根PEDOT/CNTs/TiO2纖維電極的顯微圖像(a)和K3[Fe(CN)6]響應(yīng)(b)Fig.11 Microscopic images (a) and K3[Fe(CN)6] response (b) of single PEDOT/CNTs/TiO2 fiber electrode

2.7 基于微流控芯片的微電極

由于微流控芯片具有良好的流體操控性能，以及模擬體內(nèi)微環(huán)境的性能，將電化學(xué)與微流控芯片結(jié)合，將大大拓展電化學(xué)在細(xì)胞檢測中的應(yīng)用。因此，本文將制得的PEDOT復(fù)合導(dǎo)電纖維集成于微流控芯片中，制備了一種簡單的基于微流控芯片的微電極(圖12a)。以K3[Fe(CN)6]為探針分子，考察了該芯片電極的電化學(xué)活性，結(jié)果顯示該電極具有良好的電化學(xué)性能(圖12b)，有望用于微流控芯片中細(xì)胞的長期培養(yǎng)和監(jiān)測。

圖12 芯片上PEDOT/CNT/TiO2光纖電極的顯微圖像(a)和K3[Fe(CN)6]響應(yīng)(b)Fig.12 Microscopic images (a) and K3[Fe(CN)6] response (b) of fiber electrode on a chip

3 結(jié)論

在本文工作中，我們采用了一種簡單拉絲的方法制備出超長PEDOT/CNTs/TiO2復(fù)合導(dǎo)電纖維，其長度可達(dá)10 cm，直徑最小可至3 μm。在此基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了兼具抗污染性能和光致清潔性能的平面微米線電極及單根微米線電極，并成功用于檢測HUVECs細(xì)胞NO釋放。所制電極具有良好的電化學(xué)性能，對NO的檢出限可達(dá)4 nmol/L；在培養(yǎng)基中浸泡34 h后，其電化學(xué)性能無明顯變化，表現(xiàn)出良好的抗污染性能；在徹底污染后(無電化學(xué)響應(yīng))，經(jīng)紫外光照30 min后，其電化學(xué)性能可恢復(fù)至初始的30%，表現(xiàn)出一定的光致清潔能力。該電極有望用于細(xì)胞的長期培養(yǎng)和監(jiān)測。