江承佳，余寧翔，熊 華

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)，江西 南昌330047）

民以食為天，消費(fèi)者對食品安全及品質(zhì)的要求對食品的抑菌保藏性能提出更高的挑戰(zhàn)。市場的需求推動(dòng)了食品保藏技術(shù)的革新，近年來基于天然生物大分子如淀粉[1]、纖維素[2]、明膠[3]、甲殼素[4]等制備的抗菌材料用于食品包裝及儲(chǔ)藏材料備受關(guān)注?？咕牧峡梢酝ㄟ^持續(xù)地釋放抗菌劑防止食品腐敗，延長食品貨架期，實(shí)現(xiàn)包裝食品內(nèi)最少或無防腐劑添加，提升消費(fèi)者對此類包裝食品的可接受度。

甲殼素是由2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄聚糖以β-1，4糖苷鍵連接構(gòu)成的線型聚合物，是地球上含量僅次于纖維素的第二大可再生多糖類資源[5]，來源豐富，廣泛存在于甲殼類動(dòng)物的外殼、昆蟲類動(dòng)物的表皮以及藻類的細(xì)胞壁中[6]，年生物合成量超過100億噸。因其具有優(yōu)良的生物安全性、可降解性以及抗菌性等性能，被廣泛地應(yīng)用于食品包裝材料[7]、納米材料[8-10]、抗菌材料[11-12]以及重金屬吸附材料[13-14]等領(lǐng)域。甲殼素通過溶膠-凝膠法可制備三維多孔納米纖維微球[15]，其多孔結(jié)構(gòu)為納米級抗菌劑的加入提供了可能[16]。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀具有抗菌譜廣、細(xì)菌耐藥性較低以及安全性高等特性，被認(rèn)為是抑制細(xì)菌生長的良好抗菌劑[17-18]。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)可以利用天然聚合物，例如淀粉[19]、葡聚糖[20]、纖維素[21]和甲殼素[22]等作為還原劑和穩(wěn)定劑，通過原位合成法制備納米銀，制備過程更加綠色，使用更加安全。

本研究中通過溶膠-凝膠法制備磁性甲殼素納米纖維微球，之后通過原位合成法將納米銀固定于甲殼素微球中。通過兩步法合成銀-磁性甲殼素微球，能夠使小尺寸的納米銀與磁珠快速分散于甲殼素微球的三維多孔結(jié)構(gòu)中。納米纖維結(jié)構(gòu)能夠有效避免納米銀地聚集，并持續(xù)釋放納米銀，達(dá)到長效抗菌活性。磁珠的加入賦予了甲殼素微球磁分離特性，可以實(shí)現(xiàn)對抗菌劑的回收再利用，避免過量的抗菌劑對人體、環(huán)境造成負(fù)擔(dān)。結(jié)果表明銀-磁性甲殼素微球可作為一種潛在的可回收型抗菌材料，有望在替代防腐劑降低食品中添加劑用量方面發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲殼素：浙江金殼生物化學(xué)有限公司產(chǎn)品，使用前純化[16]；大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、酵母提取物：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨：上海盛思生化科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；三氯化鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、乙二醇、乙醇、氫氧化鈉、尿素、異辛烷、硝酸銀、檸檬酸鈉、氯化鈉等：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JSM 5600LV掃描電子顯微鏡（SEM-EDX）、

JEM-2010HR透射電子顯微鏡（TEM）：日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品；D8-FOCUS X射線衍射儀（XRD）：德國Bruker公司產(chǎn)品；7407振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM）：美國LakeShore公司產(chǎn)品；ESCALAB X射線光電子能譜儀（XPS）：德國Omicrometer公司產(chǎn)品；820電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）：美國瓦里安公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 磁珠的制備參照Ning等[23]的方法合成磁珠（Fe3O4NPs），略做修改。1.05 g三氯化鐵，0.6 g檸檬酸三鈉和3.6 g乙酸鈉溶于60 mL乙二醇中，于室溫下劇烈攪拌30 min。然后將所得混合物密封于內(nèi)置聚四氟乙烯（100 mL）的高壓釜中，在200℃下反應(yīng)10 h。冷卻至室溫后通過磁鐵收集黑色產(chǎn)物，通過乙醇和超純水洗滌數(shù)次，并在60℃下干燥得到磁珠粉末。

1.3.2 磁性甲殼素微球的制備參照Duan等[16]的方法制備磁性甲殼素微球（Fe3O4-NMs）。將5 g純化后的甲殼素粉末分散于含氫氧化鈉、尿素和去離子水的混合溶液中（質(zhì)量比8∶4∶88），通過反復(fù)凍融獲得透明的甲殼素溶液。0.4 g磁珠經(jīng)超聲（5 min）分散于5 mL水中，與甲殼素溶液于0℃下混合。圓底燒瓶中加入1.1 g司班85和50 g異辛烷，0℃下1 000 r/min攪拌30 min后，加入磁珠-甲殼素混合物并繼續(xù)攪拌1 h。隨后加入0.6 g吐溫85和3.5 g異辛烷繼續(xù)攪拌1 h形成穩(wěn)定的油包水型乳液滴，60℃水浴加熱10 min。最后，通過磁鐵分離產(chǎn)物，分別用水、乙醇、叔丁醇清洗3次，凍干后得到磁性甲殼素微球備用。

1.3.3 銀-磁性甲殼素微球的制備參照Guo等[22]的方法略做修改，利用原位合成的方法制備銀-磁性甲殼素微球（Ag-Fe3O4-NMs）。25 mg磁性甲殼素微球分散于12 mL硝酸銀溶液（8 mmol/L）中，攪拌24 h后，加入0.8 mL檸檬酸鈉溶液（50 mmol/L），并于80℃下攪拌約1.5 h直至懸浮液由黃色變?yōu)樽睾谏Ｍㄟ^磁鐵分離得到銀-磁性甲殼素微球，水洗3次。

1.3.4 納米銀體外釋放研究50 mg銀-磁性甲殼素微球分散于10 mL水中，置于透析袋中（截留相對分子質(zhì)量3.5×103）。采用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0）作為釋放介質(zhì)，將透析袋浸入1 000 mL PBS中，37℃、50 r/min振蕩21 d。在特定時(shí)間點(diǎn)，移取10 mL釋放介質(zhì)并補(bǔ)充同體積新鮮介質(zhì)，通過ICP-MS測定銀質(zhì)量濃度。

1.3.5 菌液的制備以大腸桿菌（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）為模型菌。將2種模型菌接種至LB培養(yǎng)基（酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g溶于1 L水；pH 7.0）中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，當(dāng)懸浮液細(xì)菌密度達(dá)到約108CFU/mL時(shí)，通過離心（4 000 r/min，10 min）收集細(xì)菌并用無菌去離子水洗滌3次，使用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mmol/L，pH 7.0）將細(xì)菌懸浮液稀釋至105CFU/mL。

1.3.6 抗菌實(shí)驗(yàn)采用平板計(jì)數(shù)法評價(jià)銀-磁性甲殼素微球的抗菌活性。分別向2 mL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌懸浮液中加入50μL不同質(zhì)量濃度的銀-磁性甲殼素溶液，于37℃、180 r/min振蕩下培養(yǎng)2 h。然后，移取所得混合物（50μL）涂布到LB瓊脂平板中。在37℃培養(yǎng)24 h后，對培養(yǎng)板上的細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。對不同處理時(shí)間（15、60、120 min）以及不同銀-磁性甲殼素微球質(zhì)量濃度（6.25、12.5、25、50、100μg/mL）的抗菌效果進(jìn)行評價(jià)。

1.3.7 細(xì)菌形態(tài)觀察大腸桿菌經(jīng)PBS，銀-磁性甲殼素微球（50μg/mL）處理30 min后，加入預(yù)冷的戊二醛溶液（4%，體積分?jǐn)?shù)）固定于蓋玻片上（2.5 h，4℃），之后通過鋨酸溶液（10 g/L）固定2 h。隨后，在一系列乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%和100%）中分別脫水20 min。最后，經(jīng)超薄切片，乙酸鈾（20 g/L）染色后，置于銅網(wǎng)上用于透射電鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)3組平行，采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±SD）形式表示，通過Origin 2019軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁珠的基本特性

利用乙二醇為還原劑，檸檬酸三鈉為黏合劑，在高溫環(huán)境下制備了Fe3O4NPs。通過TEM對磁珠形態(tài)外觀進(jìn)行觀察，圖1（a）和（b）可以看出Fe3O4NPs呈球形，大小均一，顆粒直徑約在100～150 nm，表面粗糙，外部呈現(xiàn)較為疏松狀態(tài)。圖1（b）的插圖為磁珠的晶體衍射圖，由圖可看出，F(xiàn)e3O4NPs表現(xiàn)出良好的晶體特征。對磁珠進(jìn)行EDX分析（見圖1（c）），鐵元素特征峰的出現(xiàn)進(jìn)一步說明通過高溫反應(yīng)法成功制備了Fe3O4NPs。飽和磁化強(qiáng)度是磁性材料的重要磁性參數(shù)之一，通過VSM對Fe3O4NPs的磁性進(jìn)行了測量，圖1（d）結(jié)果表明Fe3O4NPs的飽和磁化強(qiáng)度值為（59.3±2.4）emu/g。此外，圖1（d）插圖結(jié)果表明，磁珠的磁化聚集時(shí)間約為30 s，表現(xiàn)出良好的磁化聚集特性。在撤去外加磁場后，由于輕微的剩磁性質(zhì)，熱擾動(dòng)無法使磁珠重新分散，而當(dāng)施加外力搖晃時(shí)，磁珠能夠快速均勻分散。

圖1 磁珠基本特征分析Fig.1 Characterization of Fe3O4 NPs

2.2 磁性甲殼素微球的基本特性

通過SEM對Fe3O4-NMs進(jìn)行外觀形態(tài)觀察（見圖2（a）和（b）），可以看出Fe3O4-NMs呈球形，具有三維多孔納米結(jié)構(gòu)，且多孔之間相互連接。在甲殼素溶膠-凝膠過程中，凝膠時(shí)的相分離作用形成了微球的多孔結(jié)構(gòu)[16]。多孔結(jié)構(gòu)賦予了微球較大的運(yùn)載能力，使得其能夠成功地運(yùn)載Fe3O4，并且為接下來原位合成運(yùn)載納米銀提供了可能性。圖2（b）顯示Fe3O4-NMs內(nèi)部呈納米纖維狀，且可觀察到Fe3O4NPs嵌于納米纖維結(jié)構(gòu)中。從圖2（c）的插圖中可以看出，F(xiàn)e3O4-NMs的粒徑分布在10～50μm之間。EDX分析（見圖2（c））中，鐵元素峰的出現(xiàn)，進(jìn)一步說明了微球中Fe3O4NPs的存在。圖3（a）為Fe3O4-NMs的XRD圖 譜，其 中，2θ=12.9°（021）、21.3°（110）、23.8°（101）和26.7°（130）為α-甲殼素的特征峰，衍射峰35.4°（311）和57.2°（511）為Fe3O4NPs的特征峰。Fe3O4NPs的成功運(yùn)載賦予了微球磁分離能力，便于抗菌劑的回收，降低過量抗菌劑對環(huán)境造成的污染。

2.3 銀-磁性甲殼素微球的基本特性

通過SEM對Ag-Fe3O4-NMs的外觀形態(tài)進(jìn)行觀察（見圖2（d）），與Fe3O4-NMs相比，銀納米粒子固定后，Ag-Fe3O4-NMs的外觀形態(tài)以及粒徑分布沒有發(fā)生明顯的變化（見圖2（a）和（d）），這是由于納米銀是通過原位合成的方法固定在了Fe3O4-NMs的多孔結(jié)構(gòu)[22]。但在固定納米銀后，Ag-Fe3O4-NMs呈現(xiàn)出相對較密的表面（見圖2（e）），這可能是由于在甲殼素納米纖維表面上形成了納米銀。同時(shí)，在Ag-Fe3O4-NMs的EDX分析中（見圖2（f）），銀元素峰的出現(xiàn)進(jìn)一步表明了納米銀成功的固定在了Fe3O4-NMs上。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[24]，甲殼素分子鏈上的酰胺鍵（N-C=O）能夠與銀原子形成配位鍵，使得銀原子能夠均勻地在甲殼素分子鏈上聚集。與Fe3O4-NMs相比較，Ag-Fe3O4-NMs的XRD圖譜 中（見圖3（a）），出現(xiàn)了4個(gè)新的衍射峰，分別位于38°（111）、44°（200）、64°（220）和77°（311），表明Ag晶體以面心立方（Face-centered cubic，F(xiàn)cc）晶格形式存在于Fe3O4-NMs中[25-26]。有趣的是，在Ag-Fe3O4-NMs的XRD譜圖中未出現(xiàn)Fe3O4NPs的特征峰，這可能是由于銀的特征峰過強(qiáng)，掩蓋住了Fe3O4NPs的特征峰，同時(shí)，α-甲殼素的特征峰也減弱了。為了進(jìn)一步研究納米銀與甲殼素分子鏈之間的關(guān)系，對Ag-Fe3O4-NMs紅外光譜進(jìn)行了分析（見圖3（b）），出現(xiàn)在3 470 cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)和甲殼素分子矩陣之間的氫鍵。在1 670 cm-1和1 580 cm-1的強(qiáng)烈振動(dòng)分別歸屬于甲殼素分子中的酰胺I和酰胺II。1 070 cm-1為甲殼素分子中C-O-C的伸縮振動(dòng)。對比Fe3O4-NMs和Ag-Fe3O4-NMs的紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)，在固定納米銀的過程中，甲殼素的主要結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。

圖2 Fe3O4-NMs的SEM外形觀察分析Fig.2 SEM images of Fe3O4-NMs

2.4 銀-磁性甲殼素微球中納米銀的釋放研究

銀的釋放速率是評價(jià)銀基抗菌材料性能的重要指標(biāo)之一[27]。研究報(bào)道，當(dāng)銀質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 μg/L時(shí)即能有效抑制細(xì)菌的生長[25]。本研究中分析了在中性pH環(huán)境下，Ag-Fe3O4-NMs中銀的釋放行為（見圖3（c））。結(jié)果表明，第1天Ag釋放質(zhì)量濃度約為（10.3±1.4）μg/L，能有效地抑制細(xì)菌的生長。Ag-Fe3O4-NMs中Ag的釋放量在5 d內(nèi)急劇增加，在第5～21天時(shí)逐漸減緩，21 d Ag累計(jì)釋放量約為（264±16）μg/L，低于毒性質(zhì)量濃度（10 mg/L）[28]。表明Ag-Fe3O4-NMs具有長期且穩(wěn)定的Ag釋放活性，有助于在細(xì)菌表面快速達(dá)到并保持有效抗菌濃度，防止納米銀在凋亡細(xì)菌或者介質(zhì)中發(fā)生聚集，從而增強(qiáng)抗菌效果。

圖3 Fe3O4-NMs及Ag-Fe3O4-NMs XRD圖譜、紅外光譜；Ag-Fe3O4-NMs中Ag釋放量Fig.3 XRD analysis and FT-IR spectrum of Fe3O4-NMs and Ag-Fe3O4-NMs，respectively；cumulative release amount of sliver from Ag-Fe3O4-NMs in PBS

2.5 銀-磁性甲殼素微球的抗菌評價(jià)

為了研究Ag-Fe3O4-NMs的抗菌性能，通過測定細(xì)菌的生存能力（菌落計(jì)數(shù)）對Fe3O4NPs、Fe3O4-NMs和Ag-Fe3O4-NMs的抗菌能力進(jìn)行了定性評估（25μg/mL，120 min）如圖4（a）所示，對于Fe3O4NPs、Fe3O4-NMs處理組，培養(yǎng)基上仍長有大量菌落，與PBS處理組無明顯區(qū)別，表明較低質(zhì)量濃度的Fe3O4NPs、Fe3O4-NMs對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無明顯抗菌作用，同時(shí)反映出甲殼素微球在裝載了Fe3O4NPs之后并不能提高其抗菌性能。而Ag-Fe3O4-NMs組大腸桿菌的生長受到了明顯的抑制，同時(shí)絕大多數(shù)金黃色葡萄球菌的生長受到了抑制。

為了進(jìn)一步評價(jià)其抗菌性能，對不同處理時(shí)間（15、60、120 min）和不同Ag-Fe3O4-NMs質(zhì)量濃度（6.25、12.5、25、50、100μg/mL）的抗菌效果進(jìn)行了測試。圖4（b）和（c）分別為Ag-Fe3O4-NMs處理后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的存活率。對2種細(xì)菌，Ag-Fe3O4-NMs呈現(xiàn)出類似的抗菌效果，在開始階段細(xì)菌存活率快速降低，隨著處理時(shí)間的增加而趨于平穩(wěn)。隨著Ag-Fe3O4-NMs質(zhì)量濃度的增加，2種菌的存活率逐漸降低，說明Ag-Fe3O4-NMs的抗菌效果具有質(zhì)量濃度相關(guān)性。當(dāng)Ag-Fe3O4-NMs質(zhì)量濃度增加后，其抗菌效果由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)闇缇Ｔ谙嗤腁g-Fe3O4-NMs質(zhì)量濃度及處理時(shí)間下，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的存活率有所不同。大腸桿菌經(jīng)12.5μg/mL的Ag-Fe3O4-NMs處理60 min后，其存活率為（54.0±4.7）%，而對于金黃色葡萄球菌，相同處理時(shí)間，需要約40μg/mL的Ag-Fe3O4-NMs才能達(dá)到相同的抑制效果。當(dāng)Ag-Fe3O4-NMs質(zhì)量濃度達(dá)到50μg/mL，經(jīng)60 min處理后，大腸桿菌將完全喪失活力，金黃色葡萄球菌在50μg/mL和120 min處理?xiàng)l件下也將完全喪失活力。二者對抗菌劑敏感性的差異是由于革蘭氏陰性菌在細(xì)胞質(zhì)和外膜之間只有一層薄薄的肽聚糖層（約2～3 nm），而革蘭氏陽性菌的肽聚糖層更厚（約30 nm），使得金黃色葡萄球菌有更強(qiáng)的耐抑制力[29-30]。

2.6 銀-磁性甲殼素微球抗菌機(jī)理研究

利用TEM證實(shí)了細(xì)菌與抗菌材料的相互作用。如圖4（d）所示，未經(jīng)處理的大腸桿菌表面光滑完整，無任何破裂，且細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)飽滿無空缺。而經(jīng)Ag-Fe3O4-NMs處理后（見圖4（e）），大腸桿菌的桿狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)菌表面變的粗糙且有塌陷和起皺現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)出現(xiàn)泄漏，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)密度急劇下降，部分桿菌出現(xiàn)菌體收縮。TEM的結(jié)果進(jìn)一步說明Ag-Fe3O4-NMs能夠破壞細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)，從而殺滅細(xì)菌。

通過上述抗菌實(shí)驗(yàn)，抗菌機(jī)理可能為：通過靜電相互作用，Ag-Fe3O4-NMs能夠輕松的識(shí)別并捕獲帶負(fù)電荷的細(xì)菌，并在細(xì)菌周圍持續(xù)釋放納米銀發(fā)揮抗菌活性。納米銀會(huì)造成細(xì)菌結(jié)構(gòu)的破壞，并穿透細(xì)胞質(zhì)，使得蛋白質(zhì)與酶失活，實(shí)現(xiàn)抗菌作用。在本研究中，大部分的納米銀固定在Ag-Fe3O4-NMs的表面，使得納米銀能夠從微球中快速釋放，短時(shí)間內(nèi)達(dá)到有效抗菌質(zhì)量濃度，并能在后續(xù)很長一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放納米銀，維持有效抗菌質(zhì)量濃度，在生物安全劑量內(nèi)發(fā)揮抗菌活性。

圖4銀-磁性甲殼素微球抗菌機(jī)理示意Fig.4 Schematic diagram of antibacterial mechanism of Ag-Fe3O4-NMs

3 結(jié)語

通過甲殼素納米纖維的自組裝作用以及原位合成法成功制備了銀-磁性甲殼素微球，通過掃描電子顯微鏡可觀察到三維多孔納米纖維結(jié)構(gòu)，磁珠、納米銀嵌于纖維結(jié)構(gòu)之中。微球中納米銀的突釋以及持續(xù)釋放使其具有快速、長效的抗菌活性，抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明磁珠以及磁性甲殼素微球均不具有抗菌能力，而銀-磁性甲殼素微球?qū)Υ竽c桿菌以及金黃色葡萄球菌均呈現(xiàn)質(zhì)量濃度相關(guān)性抗菌作用，且抗大腸桿菌效果更佳。微球可通過靜電相互作用識(shí)別捕獲細(xì)菌，通過破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，使其內(nèi)容物流出，生物活性大分子失活達(dá)到抗菌作用。天然的可再生資源以及綠色的制備條件賦予了銀-磁性甲殼素微球良好的生物安全性以及生物相容性，磁珠的加入賦予了抗菌微球分離回收再利用的能力，降低對環(huán)境的污染，為減少食品中防腐劑的添加、延長貨架期提供新思路。