朱政明，張 娟，堵國成，3，吳志猛

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

應(yīng)用微生物細(xì)胞工廠進(jìn)行相關(guān)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵法生產(chǎn)已廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、紡織等眾多領(lǐng)域[1]。在這些工業(yè)產(chǎn)品的發(fā)酵法生產(chǎn)過程中，由于碳代謝流的轉(zhuǎn)化，其導(dǎo)致的產(chǎn)酸積累是微生物代謝過程中必不可少的部分[2]。微生物的代謝產(chǎn)酸對促進(jìn)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)本體細(xì)胞的環(huán)境競爭性等具有積極的作用。然而，隨著胞內(nèi)代謝產(chǎn)物持續(xù)不斷積累，導(dǎo)致胞內(nèi)pH不斷下降，從而使得維持細(xì)胞正常生理功能的相關(guān)酶類活性受到嚴(yán)重抑制，影響了細(xì)胞的代謝活性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。另外細(xì)胞膜流動性的降低影響了胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，并為下游的加工處理以及工業(yè)排放物的治理埋下了諸多隱患[3]。因此，提高微生物細(xì)胞的酸脅迫耐受性，增強(qiáng)其在酸性環(huán)境下的代謝活性與生產(chǎn)效率，成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界急需解決的問題。

基于對微生物酸脅迫耐受性機(jī)制的深入解析，提高微生物細(xì)胞對酸脅迫環(huán)境的耐受性已成為微生物生理功能研究的重要組成部分。近年來，隨著合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，新技術(shù)的出現(xiàn)為微生物耐酸機(jī)制的解析、抗酸脅迫元器件的發(fā)掘和構(gòu)建奠定了堅(jiān)定的理論與技術(shù)基礎(chǔ)。目前，對抗酸脅迫元器件的研究主要集中于對相關(guān)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因以及代謝/解毒模塊的研究。對結(jié)構(gòu)基因抗酸元器件的研究主要集中于F1F0-ATPase、脲酶等多亞基編碼蛋白的結(jié)構(gòu)解析及功能驗(yàn)證[4-5]。對調(diào)控基因型抗酸元器件的研究目前主要集中于對分子伴侶、應(yīng)激蛋白的功能解析及分子改造[6-7]。解毒/代謝模塊是抗酸元器件中的重要組成部分，目前對其中的精氨酸脫氨酶系統(tǒng)（Arginine deiminase，ADI）和鯡精氨脫氨酶系統(tǒng)（Agmatine deiminase system，AgDS）已進(jìn)行了較為深入的研究[8]。

目前關(guān)于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中酸脅迫耐受性提升的研究已有部分報(bào)道。Wu等通過在L.lactis NZ9000中異源表達(dá)來自干酪乳桿菌的DNA修復(fù)蛋白RecO，提升了菌株對酸脅迫的耐受性以及乳酸產(chǎn)量[9]。Abdullah等通過在L.lactis NZ9000中異源表達(dá)來自大腸桿菌的分子伴侶DNA蛋白，重組菌株在0.5 g/dL的乳酸（pH 5.47）脅迫下，其最大生物量是對照菌株的1.44倍[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在L.lactis MG1363中過量表達(dá)小熱休克蛋白Lo18，明顯提升了菌株對酸脅迫和熱脅迫的耐受性[10]。關(guān)于L.lactis中酸脅迫耐受性提升的研究主要集中于對分子伴侶、熱休克蛋白等一些應(yīng)激蛋白的研究，而關(guān)于其他類型的功能蛋白尤其是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白幫助乳酸乳球菌細(xì)胞提升酸脅迫耐受性目前還缺乏深入研究。

已有研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）中通過敲除thiT基因，敲除菌株對酸脅迫敏感，其對酸脅迫的耐受性低于未敲除thiT基因的對照菌株[11]。另外研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中通過外源添加硫胺素可幫助細(xì)胞抵御氧脅迫[12]?；诖?，本研究中通過在乳酸乳球菌中過表達(dá)ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，考察了重組菌株對酸脅迫耐受性的影響，并利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了重組菌株耐受酸脅迫的具體響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒本研究中所用的菌株和質(zhì)粒詳見表1。

1.1.2 主要試劑Prime STAR（mix）DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及T4 DNA連接酶：購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒：購自天根生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Nco I和Xba I：購自Thermo Scientific公司；Nisin：購買自Sigma公司；蛋白胨、酵母粉以及M17肉湯培養(yǎng)基：購買自O(shè)xoid公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成及測序均由上海生工有限公司完成。實(shí)驗(yàn)中，氯霉素添加的質(zhì)量濃度分別為大腸桿菌中添加質(zhì)量濃度為100μg/mL，乳酸乳球菌中添加質(zhì)量濃度10μg/mL。誘導(dǎo)劑Nisin的添加質(zhì)量濃度為10 ng/mL。

表1 研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH 7.4。GM17培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基補(bǔ)充5 g/L葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建pNZ8148/thiT的構(gòu)建過程如圖1所示。首先以乳酸乳球菌 （L.lactis NZ9000）的基因組DNA為模板，以pNZ8148/thiT-F和pNZ8148/thiT-R為引物，通過PCR擴(kuò)增并膠回收得到片段thiT；然后將表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148和片段用Nco I和Xba I雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶連接6～8 h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli MC1061，最后用引物pNZ8148-F和pNZ8148-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并挑取條帶大小約800 bp的克隆子進(jìn)行測序驗(yàn)證，得到質(zhì)粒pNZ8148/thiT。所用引物序列見表2。將空質(zhì)粒pNZ8148和重組質(zhì)粒pNZ8148/thiT電轉(zhuǎn)化進(jìn)入L.lactis NZ9000，通過氯霉素抗性的平板篩選獲得對照菌株L.lactis（Vector）和重組菌株L.lactis（ThiT）。

圖1 pNZ8148/thiT質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of plasmid pNZ8148/thiT

表2 本研究所用的引物及序列Table 2 Primers used in this study

1.2.2 生長曲線的測定將經(jīng)過活化的種子培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入GM17培養(yǎng)基（含10μg/mL的氯霉素），30℃靜置培養(yǎng)至OD6000.4左右，加入10 ng/mL的Nisin誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔2 h取樣，使用多功能酶標(biāo)儀測定OD600處的吸光值，以GM17培養(yǎng)基為空白對照。最后以O(shè)D600為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制對照菌株和重組菌株的生長曲線。每個(gè)菌株測定3個(gè)平行，計(jì)算其平均值。

1.2.3 酸脅迫下的存活率測定根據(jù)1.2.2生長至OD6000.4左右的菌液加入10 ng/mL的Nisin誘導(dǎo)培養(yǎng)（5 h），取4 mL的菌液于8 000 g離心5 min后用等體積的生理鹽水（0.85 g/dL）洗滌離心2次，加入等體積的脅迫培養(yǎng)基（GM17，pH 4.0，含10μg/mL的氯霉素和10 ng/mL的Nisin）進(jìn)行脅迫處理。分別脅迫不同的時(shí)間取樣后，離心洗滌，用生理鹽水等體積重懸后梯度稀釋至適宜的菌體濃度，然后取10 μL分別點(diǎn)樣于GM17的固體平板上，于30℃條件下培養(yǎng)24 h左右。最后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率，存活率的計(jì)算方法參考之前報(bào)道的方法[16]。

1.2.4 RNA樣品的提取將誘導(dǎo)培養(yǎng)至對數(shù)中期（4 h）的微生物細(xì)胞于8 000 g離心5 min后用預(yù)冷的50 mmol/L的PBS（pH 7.4）離心洗滌2次后收集菌體，加入等體積的脅迫培養(yǎng)基（GM17，pH 4.0，含10μg/mL的氯霉素和10 ng/mL的Nisin）進(jìn)行脅迫處理。然后分別脅迫0 h和2.5 h后離心洗滌并收集菌體，迅速放入液氮中凍存。最后采用液氮研磨菌體，并按照RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit說明書提取總RNA。使用NanoDrop ND-2000對純化的RNA進(jìn)行定量并將其保存于-80℃冰箱。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析RNA樣品送往南京諾唯贊生物有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序所得的數(shù)據(jù)成為raw data，隨后對raw data進(jìn)行質(zhì)控（QC）。質(zhì)控后，經(jīng)過濾得到clean reads，然后用HISAT2[17]將clean reads比對到參考序列上。比對完，通過統(tǒng)計(jì)reads在參考序列上的分布情況和覆蓋度，以此判斷比對結(jié)果是否可靠。之后采用RSEM[18]計(jì)算基因的表達(dá)量。差異表達(dá)基因的分析采用DEGseq[19]的方法進(jìn)行分析。我們將差異倍數(shù)為2倍以上且pValue≤0.05的基因篩選為顯著差異表達(dá)基因。基于Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫，采用phyper對分別差異基因進(jìn)行GO功能富集分析和pathway功能富集分析，隨后對pValue進(jìn)行FDR校正，并以FDR≤0.01的功能視為顯著富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的生長性能分析

為了考察過表達(dá)ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對乳酸乳球菌生長的影響，實(shí)驗(yàn)測定了乳酸乳球菌在正常生長條件下的生長曲線。如圖2（a）所知，根據(jù)生長曲線可以確定對數(shù)中期的培養(yǎng)時(shí)間約為4 h。同時(shí)，圖2所示的重組菌株和對照菌株的生長情況基本相同，在對數(shù)期重組菌株的菌體濃度略微低于對照菌株，且生長過程中2株菌株的環(huán)境pH基本相同。推測這可能是由于加入Nisin誘導(dǎo)培養(yǎng)后，重組菌株由于重組蛋白開始快速表達(dá)，給菌體細(xì)胞的代謝造成一定的代謝負(fù)擔(dān)所導(dǎo)致[20]。

圖2 L.lactis的生長分析Fig.2 Growth analysis of L.lactis

2.2 過表達(dá)ThiT提高L.lactis NZ9000的酸脅迫耐受性

基于重組菌株的生長情況，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了對照菌株和重組菌株在酸脅迫條件下的存活率。在乳酸乳球菌代謝過程中，隨著主要代謝產(chǎn)物乳酸的不斷積累，胞外pH也隨之不斷地下降，最低可降至pH 4.5～5.0，而在pH 4.0的條件下，乳酸乳球菌的存活率迅速下降。因此本研究中選擇pH 4.0作為考察乳酸乳球菌存活率的實(shí)驗(yàn)pH[21-22]。

如圖3所示，經(jīng)過pH 4.0脅迫處理后，重組菌株的存活率明顯高于對照菌株，且隨著脅迫時(shí)間的延長，兩者之間的差距逐漸增大，在脅迫2.5 h后，兩者之間存活率差距達(dá)到最大，此時(shí)重組菌株的存活率是對照菌株的16.2倍。在脅迫3 h后，2株菌之間的存活率差距有所縮小，重組菌株的存活率是對照菌株的2.4倍。通過存活率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可顯著提高乳酸乳球菌的酸脅迫耐受性。

圖3 酸脅迫條件下過表達(dá)ThiT對L.lactis NZ9000存活率的影響Fig.3 Effect of ThiT overexpression on the survival rates of L.lactis NZ9000 during acid stress

2.3 過表達(dá)ThiT對乳酸乳球菌轉(zhuǎn)錄組水平的影響

為進(jìn)一步揭示ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白幫助細(xì)胞耐受酸脅迫的具體作用機(jī)制，通過比較轉(zhuǎn)錄組分析研究了對照菌株和重組菌株在酸脅迫前后的轉(zhuǎn)錄水平變化。如圖4所示，在正常培養(yǎng)條件下，與對照菌株相比，重組菌株差異表達(dá)基因有207個(gè)，其中有116個(gè)基因發(fā)生了顯著上調(diào)，91個(gè)基因發(fā)生了顯著下調(diào)。另外，在酸脅迫條件下，相比較對照菌株，重組菌株差異表達(dá)基因有201個(gè)，其中有99個(gè)基因發(fā)生了顯著上調(diào)，102個(gè)基因發(fā)生了顯著下調(diào)。兩組比較情況下，共155個(gè)基因同時(shí)出現(xiàn)了顯著上下調(diào)，初步分析這些顯著差異表達(dá)的基因可能和乳酸菌細(xì)胞抵御酸脅迫有關(guān)。

圖4 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的差異基因分析Fig.4 Significant differentially expressed genes in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

為進(jìn)一步揭示這些差異表達(dá)基因參與的具體細(xì)胞生理功能和代謝途徑，分別對兩組比較情況下的差異基因進(jìn)行GO和Pathway功能富集分析。由圖5可知，GO功能顯著性分析發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)條件下，重組菌株中差異表達(dá)的基因主要參與轉(zhuǎn)運(yùn)過程，尤其是營養(yǎng)物質(zhì)如糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)（圖5（a））。同樣地，在酸脅迫條件下，重組菌株中差異表達(dá)的基因主要參與碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)膜的過程（圖5（b））。由此可以分析過表達(dá)ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可提高細(xì)胞對碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，酸脅迫條件下碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的增強(qiáng)可為提高抵御酸脅迫提供更多的能量[23]。通過Pathway顯著性富集發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)和酸脅迫條件下，差異表達(dá)基因主要參與PTS途徑和糖代謝途徑 （圖5（c）、（d））。差異基因的Pathway富集結(jié)果和GO的富集分析結(jié)果成正相關(guān)性，進(jìn)一步解釋了GO富集分析的結(jié)果。

為深入解析在兩組比較情況下，共有差異基因參與的細(xì)胞功能和代謝過程。進(jìn)一步對共有的差異基因進(jìn)行GO和Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，這些共有的差異基因主要參與細(xì)胞的胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，尤其是對糖類等營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)（圖6（a）（b））。為了應(yīng)對酸脅迫的環(huán)境，細(xì)胞通過加強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而強(qiáng)化細(xì)胞的碳代謝途徑，以提供更多的能量，提供的能量在細(xì)胞抵御酸脅迫的過程中被消耗掉，從而幫助細(xì)胞更好地抵御酸脅迫的環(huán)境[24]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，酸脅迫條件下，過表達(dá)ThiT蛋白對胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程具有較大影響，因此本研究中對轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的相關(guān)差異基因進(jìn)行了具體分析。見圖7（a），oppD（ABC家族的ATP結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、oppF（寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)的ATP結(jié)合蛋白）、bioY（生物素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和busAA（甘氨酸、甜菜堿ABC轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白）等基因在正常以及酸脅迫條件下均發(fā)生了顯著上調(diào)。OppD和OppF都屬于ABC家族的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們的顯著上調(diào)可幫助細(xì)胞在酸脅迫條件下更高效地轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽，而轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)的寡肽可被分解成氨基酸，多種氨基酸已被證實(shí)可幫助細(xì)胞抵御酸脅迫的損傷。Wang等通過在唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）中過表達(dá)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)底物結(jié)合蛋白OppA明顯提高了重組菌株對多種脅迫的耐受性[25]。此外，busAA基因的顯著上調(diào)，可幫助酸脅迫條件下的細(xì)胞更多地轉(zhuǎn)運(yùn)甘氨酸和甜菜堿等物質(zhì)，而甜菜堿已被證實(shí)可提高細(xì)胞的酸脅迫耐受性[26]。作者繼續(xù)考察了過表達(dá)ThiT蛋白對胞內(nèi)硫胺素合成途徑中關(guān)鍵基因的影響。如圖7（b）所示，在正常條件和酸脅迫條件下，過表達(dá)ThiT蛋白，顯著提高了thiT基因的轉(zhuǎn)錄水平，其轉(zhuǎn)錄水平分別提高了699和1 859倍，說明thiT基因在L.lactis NZ9000中成功轉(zhuǎn)錄，且其轉(zhuǎn)錄水平得到顯著提高。另外，研究發(fā)現(xiàn)硫胺素合成途徑中的基因thiDEM也發(fā)生了顯著上調(diào)，酸脅迫條件下過表達(dá)ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同時(shí)提高了胞內(nèi)硫胺素合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)一步強(qiáng)化胞內(nèi)硫胺素的合成，從而幫助細(xì)胞更高效地抵御酸脅迫的損傷。

圖5 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的GO和Pathway富集分析Fig.5 Gene ontology and pathway classification analysis in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

圖6 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的共有差異基因表達(dá)分析Fig.6 Common genes of significant differentially expressed in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

圖7 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的關(guān)鍵差異基因表達(dá)分析Fig.7 Key genes of significant differentially expressed in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

3 結(jié)語

本研究中通過過表達(dá)ThiT硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，考察了其對乳酸乳球菌酸脅迫耐受性的影響，并在此基礎(chǔ)上對重組菌株和對照菌株在正常和酸脅迫條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ThiT硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可顯著提高細(xì)胞在酸脅迫條件下的存活率，接下來通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可提高細(xì)胞對碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而為細(xì)胞抵御酸脅迫的耐受性提供更多的能量；此外寡肽、甜菜堿等相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)基因的顯著上調(diào)可幫助細(xì)胞抵御酸脅迫的損傷。作者首次報(bào)道了在乳酸菌中關(guān)于ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高酸脅迫耐受性的作用效果，為進(jìn)一步對硫胺素代謝改造提高細(xì)胞酸脅迫耐受性提供了新的思路。同時(shí)，上述研究結(jié)果也對關(guān)于ThiT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其他工業(yè)微生物中的應(yīng)用提供了重要的參考意義。