劉 芹，宋志波，崔 筱，孔維麗，胡素娟，袁瑞奇，張 燕，康源春

（河南省農業(yè)科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002）

平菇（Pleurotus ostreatus）在分類學上屬擔子菌門（Basidiomycota）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）側耳科（Pleurotaceae）側耳屬（Pleurotus）[1]。平菇子實體營養(yǎng)豐富、肉質肥厚、味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價值，是全球范圍內栽培面積最廣的食用菌之一[2]。平菇具有較好的醫(yī)療保健作用，經常食用可提高人體免疫力，降血壓，降低血液中的膽固醇含量；對肝炎、胃潰瘍、心血管疾病、糖尿病也有一定的預防和治療作用[3-5]。平菇褐斑?。╞rown bloth disease）俗稱斑點病、銹斑病、黃斑病，是平菇栽培中較為常見的一種細菌性病害，對平菇生長發(fā)育具有極大的危害[6]。平菇褐斑病的病原菌為托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii），該細菌產生的托拉斯毒素（tolaasin）通過與平菇菌絲細胞膜相互作用，導致菌絲破裂，最終使得平菇菌蓋表面產生黃褐色或深褐色的斑點，嚴重影響平菇子實體的商品價值，降低菇農的經濟效益[7]。目前對平菇褐斑病的防治多采用化學手段，但長期使用化學試劑在殺死細菌的同時會造成藥物殘留，對人體健康產生危害[7-8]。殼聚糖（chitosan）是一類含有N-乙酰-D-β(1→4)葡萄糖結構單元的多糖，具有天然無毒、良好抑菌性等優(yōu)點[9-10]。因此，通過開展殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌抑制作用研究，并對其抑菌機理進行初步探索，為平菇褐斑病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

托拉斯假單胞桿菌（JCM21853）購自日本微生物菌種保藏中心，現(xiàn)保藏于河南省農業(yè)科學院食用菌研究開發(fā)中心。

1.1.2 主要試劑與儀器設備

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基和平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA），海博生物技術有限公司；食品級殼聚糖，青島弘海生物技術有限公司；分析純氯化鎂（MgCl2）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、茜素紅、氫氧化鈉、氯化鈉、乙酸鈉（NaAc）和乙酸（HAc），天津市凱通化學試劑有限公司；丙二醛（MDA）、堿性磷酸酶和總蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

LRH-325A生化培養(yǎng)箱，廣州泰宏君科學儀器股份有限公司；Blue Star A紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科股份有限公司；LE204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；GT10-1高速離心機，上海精科天美科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌懸液制備

在LB液體培養(yǎng)基中接入已活化托拉斯假單胞桿菌單菌落，28℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。采用分光光度計在波長600 nm條件下檢測病原菌菌體密度，吸光值為0.8時，得到濃度約為1×108CFU·mL-1的供試菌液[11]。

1.2.2 MIC和MBC的測定

殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定采用梯度倍比稀釋法并加以改進[12-13]。采用體積分數(shù)為0.5%的HAc溶液配制不同濃度的殼聚糖溶液，后用1 mol·L-1NaOH將 HAc溶液 pH調至 5.6用于后續(xù)試驗。在2倍LB液體培養(yǎng)基（50 mL）中分別加入同體積殼聚糖溶液，使其終濃度分別為0.06 mg·mL-1、0.13 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、1.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1、4.00 mg·mL-1及8.00 mg·mL-1，對照組培養(yǎng)基加入等體積0.5% HAc溶液，121℃高溫滅菌30 min。接入10 μL供試菌液（終濃度約為1×104CFU·mL-1），充分混勻，于28℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用梯度稀釋法計數(shù)，以無明顯細菌生長的最小殼聚糖濃度為MIC值。將上述結果細菌無明顯生長的各濃度管分別取500 μL液體涂布于平板計數(shù)培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)皿中無明顯菌落生長的最小殼聚糖濃度定義為MBC值[14]。

1.2.3 時間對抑菌活性的影響

分別配制殼聚糖濃度為MIC、2倍MIC及4倍MIC的LB液體培養(yǎng)基，對照組培養(yǎng)基加入同體積0.5% HAc溶液，充分滅菌后，接入10 μL供試菌液（終濃度約為1×104CFU·mL-1），28℃，128 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)，分別于0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h時，各取100 μL菌液進行平板計數(shù)，并繪制菌落數(shù)和時間的關系曲線[12]。

1.2.4 殼聚糖對細菌細胞壁完整性的影響

取濃度約為 1×108CFU·mL-1的供試菌液 1 mL，4 000 r·min-1離心10 min，沉淀用生理鹽水沖洗2次后重新懸浮并調整OD600為0.6[11]。將3種濃度MIC殼聚糖溶液分別與供試菌液同體積混勻，對照組加HAc溶液，于上述培養(yǎng)條件分別處理0、3 h、6 h、9 h、12 h 和 24 h 后，4 000 r·min-1離心 10 min，取上清液檢測堿性磷酸酶的含量。

1.2.5 殼聚糖對細菌細胞膜完整性的影響

托拉斯假單胞桿菌處理步驟如1.2.4所示，將3種MIC濃度殼聚糖溶液分別與供試菌液同體積混勻，對照組加HAc溶液，于上述培養(yǎng)條件分別處理0、2 h、4 h、6 h和8 h后，采用紫外分光光度計測定上清液在260 nm及280 nm處的吸光值[12，15]。

1.2.6 殼聚糖對細菌細胞膜通透性的影響

取濃度約為 1×108CFU·mL-1的供試菌液 1 mL，4 000 r·min-1離心 10 min，沉淀用 Na2HPO4（10 mmol·L-1）、MgCl2（5 mmol·L-1，pH 7.0）配制的混合液沖洗2次后，重新懸浮并調整OD600為0.6[11]。將3種濃度殼聚糖溶液分別與供試菌液同體積混勻，對照組加HAc溶液，28℃，128 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)30 min后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清200 μL用Na2HPO4-MgCl2溶液稀釋10倍，作為待測溶液。取1 mL茜素紅溶液（3.33×104mol·L-1），1 mL NaAc-HAc緩沖液（pH 5.0）及1 mL待測溶液，混勻后測定422 nm處吸光值[9，15]。托拉斯假單胞桿菌對殼聚糖的吸收量（y，mg·mL-1）公式為：

式中：x為422 nm處測定吸光值。

1.2.7 殼聚糖對細菌MDA和胞外蛋白質含量的影響

使用3種MIC濃度殼聚糖LB液體培養(yǎng)基，對照組加HAc溶液，充分滅菌后，接入10 μL供試菌液（最終濃度約為104CFU·mL-1），28℃，128 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)，分別于0、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各取100 μL菌液進行MDA及胞外蛋白質含量的測定[16-17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組內差異采用方差分析，組間差異采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌MIC值和MBC值的測定

MIC值指能抑制供試細菌生長的最小樣品濃度，MBC值指能殺死99.9%供試細菌的最小樣品濃度[9]。試驗結果表明，殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌具有較為明顯的抑菌效果，通過倍比稀釋方法，測定殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌的MIC值和MBC 值分別為 0.25 g·mL-1和 1.0 g·mL-1。這可能因為細菌表面的pH呈中性，殼聚糖在該條件下易被析出并包裹于細菌表面，從而影響細菌的正常生理活動，并產生抑制其生長甚至殺死細菌的作用[18-19]。

2.2 時間對殼聚糖抑菌活性的影響

殼聚糖作用于托拉斯假單胞桿菌的時間曲線見圖1。

由圖1可知，隨著時間的延長對照組細菌總數(shù)明顯增多。隨著殼聚糖濃度的增加，對托拉斯假單胞桿菌的抑制作用也明顯增強，其中2倍MIC的殼聚糖能有效抑制細菌生長，使細菌數(shù)量減少，4倍MIC濃度的殼聚糖溶液對細菌作用12 h后，基本能完全抑制細菌生長。

2.3 殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌細胞壁完整性的影響

堿性磷酸酶是位于細胞壁與細胞膜之間的一種酶，當菌體細胞結構完整時，胞外堿性磷酸酶的含量很低，而當細胞壁受到破壞后，堿性磷酸酶將大量泄漏到胞外，因此該酶胞外含量可以作為檢測細胞壁完整性的指標[20]。殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌胞外堿性磷酸酶活性的影響見圖2。

如圖2所示，對照組菌體培養(yǎng)液中的胞外堿性磷酸酶活性較低，約為0.6 mU·mL-1，且在整個培養(yǎng)周期內未發(fā)生明顯變化。而不同濃度殼聚糖處理后，托拉斯假單胞桿菌培養(yǎng)液中的胞外堿性磷酸酶活性較對照組明顯增加（P＜0.05），且隨著殼聚糖濃度增加、培養(yǎng)時間的延長，其活性隨之增加，該研究結果與黃芩提取物對嗜水氣單胞菌及松脂醇對銅綠假單胞菌的作用類似[20-21]。因此表明，殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌的細胞壁可產生一定的破壞作用，使胞內物質發(fā)生泄漏而抑制其生長。

2.4 殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌細胞膜完整性的影響

很多抑菌劑作用于細菌的細胞膜，通過與細胞膜的相互作用破壞其完整性，首先導致小分子物質如K+和PO43-的釋放，而隨著破壞的進一步加劇，大分子物質如DNA、mRNA和蛋白質開始發(fā)生泄露[14-15，22]。因此通過測定細菌培養(yǎng)液在260 nm及280 nm處的吸光值，可以間接反映細菌細胞膜完整性的變化。殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌核酸類和蛋白質類物質泄露的影響見圖3。

如圖3所示，與對照相比，隨著時間的延長和殼聚糖濃度的增加，260 nm及280 nm處的吸光值顯著增加（P＜0.05），尤其是在4×MIC殼聚糖濃度、培養(yǎng)8 h時對托拉斯假單胞桿菌細胞膜的完整性破壞最大，吸光值至達到最大。

2.5 殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌細胞膜通透性的影響

研究表明，殼聚糖能夠進入腸桿菌（Enterobacter sp.）和果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）內部，可能是在酸性條件下，殼聚糖表面存在的大量陽離子基團（NH3+）可以與革蘭氏陰性菌外膜上帶負電的脂多糖、磷脂及脂蛋白等發(fā)生反應，從而破壞細胞膜的結構使其通透性增加，因此，進入細胞內部殼聚糖的含量是反映托拉斯假單胞桿菌細胞膜通透性變化的重要參數(shù)[9]。與Lou等[15]的結果類似，殼聚糖亦可以增加托拉斯假單胞桿菌細胞膜的通透性，并隨著殼聚糖濃度的升高，其進入細菌內部的含量也隨之增加。不同濃度殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌吸收殼聚糖的影響見表1。

表1 不同濃度殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌吸收殼聚糖的影響Tab.1 Effect of chitosan concentrations on the absorption of chitosan by Pseudomonas tolaasii

2.6 殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌MDA和胞外蛋白質含量的影響

MDA是脂質過氧化的代謝產物，常用作脂質過氧化的指標。MDA能進入膜脂的水相，與膜蛋白、膜磷脂上的-NH2交聯(lián)形成Schiff堿，從而導致細胞膜變硬，流動性降低，通透性增加，而使膜的功能受損，故通過檢測其含量可間接反映機體組織受損程度[23-24]。殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌MDA含量和胞外蛋白質含量的影響見圖4。

如圖4（a）所示，殼聚糖處理組中MDA含量隨著殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌作用時間的延長而增加；并且隨著殼聚糖濃度的增加，MDA的含量呈逐漸上升趨勢。當作用時間為24 h時，4倍MIC殼聚糖處理組的MDA含量為0.170 μg·mL-1，明顯高于對照組 0.025 μg·mL-1（P＜0.05）?？赡苁歉邼舛鹊臍ぞ厶沁M入托拉斯假單胞桿菌后，破壞了其細胞內的氧化還原系統(tǒng)，使胞內自由基含量增加，脂質過氧化程度加大，影響細胞正常代謝，導致細胞生長受到干擾造成細胞死亡[25-26]。

如圖4（b）所示，對照組菌體培養(yǎng)液中的胞外蛋白質含量較低，約0.06 mg·mL-1，且隨著培養(yǎng)時間的延長未發(fā)生明顯變化。而不同濃度殼聚糖處理后，托拉斯假單胞桿菌胞外蛋白質含量較對照組明顯增加（P＜0.05），且隨著培養(yǎng)時間的延長，其含量隨之升高，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。此結果與上文2.4中細菌培養(yǎng)液在280 nm處吸光值測定結果一致，進一步表明殼聚糖可能破壞了托拉斯假單胞桿菌細胞壁和細胞膜的完整性，導致胞內物質發(fā)生泄漏，使胞外蛋白含量增加。

3 結論

平菇細菌性褐斑病在國內外均嚴重發(fā)生，如不及時防治，既影響平菇轉潮，又會迅速擴散，甚至導致平菇絕收[7，27]。張瑞穎[6]研究發(fā)現(xiàn)，引起我國平菇細菌性褐斑病的病原菌是托拉斯假單胞桿菌。該細菌不僅浸染平菇，亦可引起雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、香菇（Lentinula edodes）、金針菇（Flammulina velutipes）等的褐斑病，給菇農造成嚴重經濟損失[7，27]。國內外對平菇細菌性褐斑病的防治主要是在栽培過程中使用農用鏈霉素、金霉素、春日霉素等化學物質[8]。但平菇子實體生長期較短，一旦使用化學試劑，藥劑殘留無法降解，會危害人類健康；而殼聚糖具備廣譜抑菌性、天然無毒、綠色環(huán)保的優(yōu)良性能，有廣闊的應用前景[10]。因此通過研究殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌的生長抑制作用，并對相關抑菌機制進行初步探討，發(fā)現(xiàn)殼聚糖可以明顯抑制托拉斯假單胞桿菌的生長，并且經殼聚糖處理后，托拉斯假單胞桿菌的細胞壁和細胞膜完整性受到破壞，細胞膜通透性增加，胞內物質發(fā)生泄漏，堿性磷酸酶和胞外蛋白質含量均增加。該結果表明殼聚糖對托拉斯假單胞桿菌的抑菌作用主要是作用于細胞壁、細胞膜上的靶點來實現(xiàn)，這對開發(fā)新型綠色安全的抗菌藥物奠定了重要的理論基礎。