張傳藝，黃桂紅

【摘要】目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討異槲皮苷改善胰島素抵抗相關(guān)靶點(diǎn)之間的相互作用及其作用機(jī)制。 方法：通過TTD（Therapeutic Target Database）、swiss Target Prediction以及PubChem數(shù)據(jù)庫找出異槲皮苷單成分基因靶點(diǎn)，再通過DisGeNET、Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫設(shè)置篩選條件，優(yōu)選分?jǐn)?shù)及相關(guān)性高的胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，利用Venny軟件找到異槲皮苷與胰島素抵抗的共同靶點(diǎn);利用STRING、DAVID、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析及富集（GO）分析和KEGG pathway分析;通過Cytoscape軟件構(gòu)建異槲皮苷改善胰島素抵抗的“單成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)模型。結(jié)果：檢索異槲皮苷基因靶點(diǎn)114個，檢索胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)經(jīng)篩選獲取563個，異槲皮苷和胰島素抵抗的共同靶點(diǎn)24個，其中核心靶點(diǎn)18個，預(yù)測核心靶點(diǎn)INSR、PI3K、AKT2、GSK-3為關(guān)鍵靶基因在 PI3K -Akt、mTOR、胰島素抵抗、糖尿病心肌病等信號通路上參與糖異生途徑、糖代謝、脂質(zhì)代謝、抗炎等生物過程來發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用[1]。結(jié)論：異槲皮苷通過多靶點(diǎn)、多通路構(gòu)建“單成分-靶點(diǎn)-通路”的機(jī)制改善胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展，為未來研究異槲皮苷影響關(guān)鍵靶基因在信號通路上mRNA和蛋白表達(dá)作用奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) 異槲皮苷 胰島素抵抗 作用機(jī)制

【中圖分類號】R587.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.

異槲皮苷（isoquercitrin， IQ）又名羅布麻甲素 ，屬于黃酮醇類化合物，廣泛存在于砂仁、桑葉、羅布麻等多種藥用植物當(dāng)中 ，也可人工合成。異槲皮苷作為藥用植物的有效成分具有許多藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血脂等[2]。異槲皮苷具有較大的藥用價值和應(yīng)用前景，值得深入開發(fā)研究。單一成分的化學(xué)藥物可能特異性地作用于受體蛋白、生物膜通道、跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等多個不同類型的靶點(diǎn)。中藥的復(fù)雜體系，使中藥小分子與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系更加復(fù)雜。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從基因、分子水平去分析多種藥物分子作用于不同靶點(diǎn)、細(xì)胞和器官的生物學(xué)行為，能系統(tǒng)地預(yù)測和揭示不同藥物分子的作用及機(jī)制，幫助人們分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，更全面地了解藥物治療作用與疾病病理基礎(chǔ)。[3]

現(xiàn)已有部分關(guān)于異槲皮苷通過影響某些信號通路上的基因靶點(diǎn)而改善某些疾病的報道，如異槲皮苷可抑制ERK激酶（MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子1（Nrf1）表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對糖尿病腎?。―N）腎臟纖維化的修復(fù)[4]。又如異槲皮苷有誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與對Raf/MEK/ERK信號通路中相關(guān)因子的干預(yù)有關(guān)[5]。一方面，本研究可以運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提前構(gòu)建出這些基因靶點(diǎn)的理論模型，為實(shí)驗驗證節(jié)約時間;另一方面，為未來更深入研究異槲皮苷可激活胰島素抵抗等疾病相關(guān)信號通路上關(guān)鍵靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)等作用延展實(shí)驗提供一定的理論依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1材料

TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet. org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim. org）、Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）、DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html）、 Cytoscape作圖軟件。

1.2方法

1.2.1異槲皮苷靶點(diǎn)的篩選

利用TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以及 PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）找到異槲皮苷的基因靶點(diǎn)并進(jìn)行匯總。

1.2.2胰島素抵抗靶基因的篩選

利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）輸入關(guān)鍵詞“insulin resistance”查找胰島素抵抗發(fā)病基因，分別下載，其中篩選條件設(shè)置為：DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）優(yōu)選胰島素抵抗分?jǐn)?shù)≥0.1，Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）優(yōu)選胰島素抵抗相關(guān)性≥20，最后將三個數(shù)據(jù)庫中的所有基因整理匯總，作為胰島素抵抗的疾病靶基因。

1.2.3成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），針對異槲皮苷有效靶點(diǎn)和胰島素抵抗靶基因取交集，找到異槲皮苷和胰島素抵抗的共有基因靶點(diǎn)，得到相應(yīng)名稱和個數(shù)。

1.2.4 PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析（Protein-Protein Interaction，PPI）

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string- db.org/），在“Multiple proteins”一欄輸入共同靶點(diǎn)基因名稱，選擇人源基因（Homo sapines），得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做圖，同時設(shè)置最低要求互動分?jǐn)?shù)條件為 0.900及以上，得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析圖，找出關(guān)鍵基因，再作圖進(jìn)一步分析。

1.2.5富集（GO）分析和KEGG分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇“start Analysis”，在step1中輸入異槲皮苷和胰島素抵抗關(guān)鍵靶點(diǎn)，接著在step2中的“選擇鑒別”一欄中選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，同時在step2a中設(shè)置篩選條件中種屬選擇智人（homo sapiens），在step3中選擇基因列表。在“Functional Annotation Tool ”功能注釋中僅勾選“Gene_Ontology ”中的“GOTERM_BP_DIRECT”、“GOTERM_CC_DIRECT”和“GOTERM_MF_DIRECT”以及“Pathways”中的“KEGG_PATHWAY”得到可視化表格并進(jìn)行下載。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html），在“KEGG mapping” 里找到“KEGG mapper”，點(diǎn)開進(jìn)入，找到“Search&Color Pathway （and Brite， Module）”，輸入關(guān)鍵靶點(diǎn)，篩選條件是種屬為人，即選擇“homo sapience pathway”。選擇靶點(diǎn)數(shù)量較多出現(xiàn)在通路圖上的進(jìn)行分析，著重分析與胰島素抵抗相關(guān)的通路和通路上的靶點(diǎn)。

1.2.6 藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病Cytoscape作圖可視化分析利用Cytoscape作圖軟件繪制異槲皮苷和胰島素抵抗“單成分藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系驗證異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1異槲皮苷單成分靶點(diǎn)

通過TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以及 PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）找到異槲皮苷的基因靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，其中TTD數(shù)據(jù)庫在“target”結(jié)果中搜索出2個靶基因，分別為“AKR1B1、ACE”;Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫畫出異槲皮苷分子式圖，如圖1，搜索出“target”對應(yīng)的基因名稱“common name”下載;PubChem數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果見“BioAssay Results’中的“target name”，篩選“active”基因，共計114個。

2.2胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)

通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）輸入關(guān)鍵詞“insulin resistance”查找胰島素抵抗發(fā)病基因，分別下載，其中篩選條件設(shè)置為：DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）優(yōu)選胰島素抵抗分?jǐn)?shù)≥0.1;Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）優(yōu)選胰島素抵抗相關(guān)性≥20;OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）整理首基因。最后將三個數(shù)據(jù)庫中的所有基因刪除重復(fù)項，整理匯總，作為胰島素抵抗的疾病靶基因，共計563個。

2.3異槲皮苷與胰島素抵抗共同靶點(diǎn)

通過Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），針對異槲皮苷有效靶點(diǎn)和胰島素抵抗靶基因取交集，找到異槲皮苷和胰島素抵抗的共有基因靶點(diǎn)，共計24個，將所有共同基因名稱整理匯總，如圖2。

2.4 PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析（Protein-Protein Interaction，PPI）結(jié)果

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string- db.org/），在“Multiple proteins”一欄輸入24個共同靶點(diǎn)基因名稱，選擇人源基因（Homo sapines），得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做圖，同時設(shè)置最低要求互動分?jǐn)?shù)條件為 0.900及以上，得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析圖，找出連線緊密的核心基因18個，再將18個核心蛋白在“Multiple proteins”一欄輸入，繼續(xù)重復(fù)上述步驟，得到最終PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析圖，如圖3，4。

2.5 富集（GO）分析和KEGG分析結(jié)果

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）在“Start Analysis”頁面中首先在“Enter Gene List”一欄中輸入異槲皮苷和胰島素抵抗的核心基因靶點(diǎn)名稱，然后在“select Identifier”一欄中選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”;在“List Type”選擇“Gene List”;物種選擇人源，于是得到異槲皮苷和胰島素抵抗核心靶點(diǎn)的富集（GO）分析結(jié)果，其中生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）的功能注釋依次根據(jù)數(shù)量降序排列，分別取前10項作圖分析，如圖5，6，7;信號通路（PATHWAY）按P值升序，取前10個做餅狀圖，并進(jìn)一步分析，如圖8。接著利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html）同樣輸入人源核心基因18個，首先驗證DAVID數(shù)據(jù)庫與KEGG數(shù)據(jù)庫搜索得出的關(guān)鍵靶點(diǎn)數(shù)量較多的信號通路的疾病名稱是否基本一致，再著重分析與胰島素抵抗相關(guān)的信號通路，在胰島素抵抗信號通路圖上，肝臟細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn)有TNFα、IKKβ、INSR、PI3K、AKT2、GSK- 3，如圖10。

2.6異槲皮苷單成分-靶點(diǎn)-通路-疾病Cytoscape作圖可視化分析結(jié)果

通過Cytoscape作圖軟件繪制異槲皮苷和胰島素抵抗“單成分藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系驗證異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機(jī)制，其中通路篩選GO分析里“KEGG-pathway”中P值≤9.76E-10的信號通路，如圖11。

3結(jié)論

胰島素抵抗是細(xì)胞對胰島素的作用產(chǎn)生抵抗的一種狀態(tài)。胰島素抵抗普遍存在于多種代謝性疾病中，包括代謝綜合征（MS）、2型糖尿病、高血壓、血脂紊亂、心腦血管疾病[7]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論驗證出異槲皮苷改善胰島素抵抗的信號通路包括PI3K -Akt、mTOR、胰島素抵抗、糖尿病心肌病等[8]，其中胰島素抵抗信號通路尤為重要，在胰島素抵抗信號通路上顯示了多種作用機(jī)制：（a）通過絲氨酸/蘇氨酸激酶（如JNK1和IKKB）和蛋白激酶C增加IRS（胰島素受體底物）蛋白的磷酸化;（b）通過mTOR信號途徑增加IRS-1蛋白酶體的降解;（c）降低信號分子的活化包括PI3K和AKT[9-10];（d）磷酸酶（包括PTPs、PTEN和PP2A）活性的增加。另外，胰島素抵抗導(dǎo)致GLUT4易位減少，導(dǎo)致骨骼肌葡萄糖攝取和糖原合成增加，以及肝臟糖異生和糖原合成減少[11]。由胰島素抵抗信號通路得知異槲皮苷改善胰島素抵抗的主要途徑之一是通過激活肝臟PI3K/AKT信號通路改善胰島素抵抗，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括INSR、PI3K、AKT2、GSK-3，可促進(jìn)肝糖原的合成以及葡萄糖氧化分解，達(dá)到調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝紊亂的效果。而TNFα、IKKβ關(guān)鍵靶點(diǎn)可控制炎癥因子的分泌[12]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對異槲皮苷改善胰島素抵抗的藥效成分、作用靶點(diǎn)及通路進(jìn)行了分析，預(yù)測了異槲皮苷改善胰島素抵抗的基因靶點(diǎn)與作用通路，現(xiàn)有實(shí)驗表明異槲皮苷可以改善胰島素抵抗[13]。實(shí)驗結(jié)果顯示了異槲皮苷可以通過多靶點(diǎn)、多通路改善胰島素抵抗的特點(diǎn)，初步驗證的結(jié)果則表明了網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測的可行性，為異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機(jī)制深入研究提供依據(jù)。

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作者簡介：

張傳藝（1996-），女，漢族，重慶，在讀碩士研究生，研究方向：藥學(xué)。

*通訊作者：

黃桂紅（1972-），女，藥學(xué)部主任，主任藥師，教授 ，碩士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗糖尿病藥物研究。