李國鋒 王光鎖 孫學(xué)峰 丁培堃 彭彬

臨床中，非小細胞肺癌起病隱匿且患者術(shù)后遠期生存率較低[1]，因此，探究其發(fā)病機制及分子生物學(xué)特征，明確早期診療靶標意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)為不編碼蛋白質(zhì)RNA，可調(diào)控基因的表達[2]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(CCAT1)為lncRNA的一種，最早被發(fā)現(xiàn)高表達于結(jié)腸癌組織中，近年有研究報道，lncRNA CCAT1在多種惡性腫瘤中表達異常[3-4]。但臨床對lncRNA CCAT1與非小細胞肺癌的關(guān)系報道較少。因此，本研究對100例非小細胞肺癌患者進行研究，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、標本來源

收集2018年1月至2019年12月于我院就診的100例經(jīng)手術(shù)病理確診的非小細胞肺癌患者的術(shù)后癌組織，同時收集癌旁正常組織，均經(jīng)病理證實為正常肺組織。將收集的新鮮組織經(jīng)液氮冷凍處理，保存于-80℃的冰箱中待用。

二、細胞培養(yǎng)

非小細胞肺癌細胞株A549細胞購于南京森貝伽生物公司，細胞生長于含10% 小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置為5% CO2、37℃，每2天換液一次。

三、方法

1 RT-qPCR法檢測

取50mg樣本組織超聲勻漿，嚴格按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，試劑盒購于美國GeneCopoeia公司，RNA純度和濃度應(yīng)用上海奧析科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的紫外分光光度計檢測。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，試劑盒購于賽默飛世爾科技公司，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件：45℃反應(yīng)5min，37℃反應(yīng)10min，95℃反應(yīng)30s。RT-qPCR擴增反應(yīng)根據(jù)STBR Premix Ex Taq試劑盒說明書操作，試劑盒購于大連寶生物有限公司，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件：75℃反應(yīng)30s，72℃反應(yīng)15s，60℃反應(yīng)5min，95℃反應(yīng)30s，共40個循環(huán)。lncRNA CCAT1引物由上海生工生物工程公司合成，內(nèi)參GAPDH，以2-ΔΔCt表示目的基因的表達，lncRNA CCAT1相對表達量=2-ΔΔCt值(lncRNA CCAT1)-2-ΔΔCt值(GAPDH)。

2 lncRNA CCAT1質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

設(shè)計合成lncRNA CCAT1質(zhì)粒，由大連寶生物有限公司合成，嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，試劑盒購于上海書吉生物科技有限公司，將lncRNA CCAT1質(zhì)粒與空載體轉(zhuǎn)染至A549細胞，于72h后收集轉(zhuǎn)染細胞，采用RT-qPCR法檢測重組質(zhì)粒在A549細胞中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達。

3 流式細胞術(shù)

收集轉(zhuǎn)染48h后的A549細胞與未轉(zhuǎn)染的A549細胞，根據(jù)流式細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，試劑盒購于北京凱瑞基生物科技有限公司，采用美國BD公司生產(chǎn)的流式細胞儀于細胞染色25min內(nèi)進行檢測。

4 噻唑藍(MTT)實驗

將轉(zhuǎn)染的lncRNA CCAT1質(zhì)粒、空載體的A549細胞及未轉(zhuǎn)染的A549細胞接種于96孔板，每組3個復(fù)孔，采用MTT法檢測培養(yǎng)轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后的細胞增殖情況。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、組織樣本中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達分析

非小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA CCAT1的相對表達量為(4.13±0.79)，明顯高于癌旁正常組織(2.28±0.56)，二者比較差異顯著(t=19.105，P<0.05)(見圖1)。

圖1 組織樣本中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達

二、lncRNA CCAT1對A549細胞凋亡及增殖的影響

RT-qPCR結(jié)果提示，與轉(zhuǎn)染空載體陰性對照組和未轉(zhuǎn)染對照組比較，轉(zhuǎn)染lncRNA CCAT1質(zhì)粒的A549細胞中l(wèi)ncRNA CCAT1表達較低(F=4.259，P<0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果提示，與轉(zhuǎn)染空載體陰性對照組和未轉(zhuǎn)染對照組比較，轉(zhuǎn)染48h后lncRNA CCAT1質(zhì)粒的A549細胞凋亡比例明顯較低(χ2=3.854，P<0.05)。MTT結(jié)果提示，與轉(zhuǎn)染空載體陰性對照組和未轉(zhuǎn)染對照組比較，轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后lncRNA CCAT1質(zhì)粒的A549細胞增殖能力均較高(F=3.916/5.073/3.297，P<0.05)。

三、lncRNA CCAT1的表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系

不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與非小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達存在差異(P<0.05)(見表1)。

表1 lncRNA CCAT1的表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系

討 論

lncRNA為非編碼RNA，具有多功能性，其在多種腫瘤細胞中表達失調(diào)，發(fā)揮促癌或抑癌作用[5]。有研究報道，lncRNA可通過多種信號通路影響非小細胞癌的形成和進展，可能成為潛在的診斷標記物[6]。CCAT1為2628個核苷酸長度的非編碼RNA，位于轉(zhuǎn)錄因子c-MYC附近，其在染色體8q24.21上的位置非常重要，因該區(qū)域曾被描述為“熱點”[7-8]。有研究表明，從結(jié)腸癌患者獲得的腫瘤細胞系和組織中CCAT1表達上調(diào)，且這種上調(diào)表達在惡性前病狀和疾病發(fā)生進展過程中均很明顯，包括晚期轉(zhuǎn)移性疾病，提示CCAT1在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中均起作用[9]。而在正常肝臟和小腸組織中CCAT1表達極少，甚至在許多其他人體組織中未檢測到CCAT1的表達[10]。

本研究顯示，非小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA CCAT1的相對表達量高于癌旁正常組織，結(jié)果提示，lncRNA CCAT1可能與非小細胞肺癌有關(guān)，其在癌組織中呈高表達。王寧新等[11]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌患者血漿中l(wèi)ncRNA CCAT1表達上調(diào)，其對非小細胞肺癌有一定診斷價值。本研究通過分析lncRNA CCAT1與患者臨床特征發(fā)現(xiàn)，不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與非小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達存在差異，結(jié)果提示，過表達的lncRNA CCAT1可能與非小細胞肺癌的發(fā)生進展有關(guān)，其可能發(fā)揮促癌基因的作用。單廷等[12]學(xué)者對62例胃癌患者研究，發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1在胃癌中呈高表達，且與胃癌的進展有關(guān)。陳思思等[13]學(xué)者報道，肝癌細胞中l(wèi)ncRNA CCAT1表達升高，且與肝癌臨床分期、門靜脈癌栓有關(guān)。因此，我們推測lncRNA CCAT1過表達可能促進惡性腫瘤發(fā)生進展過程。

本研究顯示，轉(zhuǎn)染lncRNA CCAT1質(zhì)粒的A549細胞中l(wèi)ncRNA CCAT1表達較低。流式細胞術(shù)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染48h后lncRNA CCAT1質(zhì)粒的A549細胞凋亡比例明顯較低。MTT結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后lncRNA CCAT1質(zhì)粒的A549細胞增殖能力均較高。以上細胞實驗結(jié)果提示，下調(diào)lncRNA CCAT1的表達可抑制非小細胞肺癌細胞的凋亡、增殖，推測lncRNA CCAT1可能是非小細胞肺癌防治的新靶點。劉麗云等[14]學(xué)者研究報道，lncRNA CCAT1在人乳頭狀甲狀腺癌組織中呈高表達，下調(diào)lncRNA CCAT1的表達可抑制細胞運動能力。潘洪麗等[15]學(xué)者對91例子宮內(nèi)膜癌患者研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CCAT1與子宮內(nèi)膜癌惡性程度有關(guān)，沉默表達 CCAT1可抑制癌細胞的遷移、侵襲。這說明lncRNA CCAT1在腫瘤細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲等過程中發(fā)揮促進作用。

綜上所述，lncRNA CCAT1在非小細胞肺癌組織中呈高表達，下調(diào)lncRNA CCAT1的表達可誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖，其或?qū)⒊蔀榉切〖毎伟┑臐撛谥委煱悬c。