朱婉凌 魏然 賈金廣

肺癌死亡率位居惡性腫瘤第一位，根據(jù)病理類型將其分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%[1]。近年來，盡管治療NSCLC的方法在不斷改善，但患者的總生存率仍沒有顯著提高[2]。免疫療法為新興的治療方法，可提高早期(或晚期)NSCLC轉(zhuǎn)移性患者的生存率[3]。免疫療法主要通過恢復(fù)宿主的免疫能力進(jìn)而識別和根除腫瘤細(xì)胞，PD-1/PD-L1是腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸的重要檢查點(diǎn)，阻斷PD-1或PD-L1均可提高抗腫瘤免疫反應(yīng)[4]。NSCLC的臨床特征除了PD-L1表達(dá)改變外，還與致癌基因和抑癌基因的改變相關(guān)[5]。NSCLC中可能涉及的突變致癌基因為絲裂原活化蛋白激酶途徑的組成部分，例如Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因和B-Raf原癌基因突變[5]。在多種癌癥中高腫瘤突變負(fù)擔(dān)，包括NSCLC在內(nèi)對免疫治療反應(yīng)較敏感，尤其是PD-1/PD-L1/CTLA-4的免疫治療[6-8]。本研究主要檢測PD-L1的表達(dá)與NSCLC相關(guān)的常見體細(xì)胞突變(EGFR、KRAS)的關(guān)系，并分析PD-L1表達(dá)與接受化療的NSCLC患者預(yù)后的影響。

資料與方法

一、一般資料

選取2013年1月-2015年1月在鄭州人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的NSCLC患者132例，男性95例，女性37例，年齡(62.4±11.7)歲。收集患者的一般臨床資料主要包括：性別、年齡、吸煙指數(shù)、病理類型、臨床化療、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和EGFR，KRAS類型。行肺癌楔形切除術(shù)、CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)取材，術(shù)后石蠟切片常規(guī)HE染色或免疫組化(immunohistochemistry，IHC)證實為NSCLC。排除手術(shù)前接受放療、化療、靶向基因治療或免疫治療的患者。術(shù)后均接受以順鉑為基礎(chǔ)的化療，包括多西他賽聯(lián)合順鉑、長春新堿聯(lián)合順鉑和紫杉醇聯(lián)合順鉑，治療周期為21d，化療3個周期，納入研究的患者均按化療計劃完成。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者同意并簽署知情同意書。

二、方法

1 IHC檢測NSCLC組織中PD-L1表達(dá)的水平

石蠟切片置于60℃烘箱中30min，室溫放涼后置于二甲苯中脫蠟，然后將玻片依次置于梯度酒精中水化，最后用PBS沖洗。取一定量EDTA緩沖液加入耐高溫微波盒中，將組織切片置于配套的塑料玻片架上，放入緩沖液中加熱。室溫自然冷卻，從緩沖液中取出玻片用PBS沖洗。吸水紙將組織周圍多余水分吸干，每張玻片加100 μl 5%BSA室溫封閉30 min。直接吸去切片上多余的BSA液體，每張切片加20 ul稀釋的PD-L1一抗(1:1000)置于濕盒中 4℃冰箱孵育過夜。從冰箱中取出，室溫復(fù)溫10 min，用PBS沖洗3次，每次5min。吸去組織周圍多余水分，每張切片加50 ul相應(yīng)種屬二抗(1:4000)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次，每次5min。每張切片加100 ul新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下觀察組織顏色變化，出現(xiàn)棕褐色時立即將切片置于自來水中終止顯色。1%鹽酸酒精中分化3-5s，自來水沖洗10 min返藍(lán)(避免直接沖刷組織)，切片經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，通風(fēng)櫥中晾干，顯微鏡下觀察。腫瘤細(xì)胞膜PD-L1陽性細(xì)胞數(shù)>25%定義為PD-L1的高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞膜PD-L1陽性細(xì)胞數(shù)≤25%定義為PD-L1的低表達(dá)。

2 EGFR、KRAS突變檢測

提取腫瘤組織樣本中DNA，PCR擴(kuò)增EGFR基因18 ～ 21外顯子、KRAS 基因2 ～ 3外顯子區(qū)域，使用PSTAR-Ⅱplus高通量基因測序儀(華因康，IDN01-M-P3)進(jìn)行測序，采用軟件Pstar-Ⅱ6.0.4 build3 進(jìn)行生物學(xué)分析。

三、統(tǒng)計分析

采用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)(%)表示，組間比較采χ2檢驗，組間生存率比較采用Log rank檢驗，單因素和多因素logistic回歸分析影響NSCLC患者生存率的危險因素，P<0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

一、PD-L1的表達(dá)水平與患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系

PD-L1高表達(dá)患者47例，低表達(dá)患者85例，兩組患者在性別、年齡、吸煙指數(shù)、病理類型、臨床化療和KRAS類型差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和EGFR類型之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 PD-L1的表達(dá)水平與患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系[n(%)]

二、PD-L1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者生存率的比較

PD-L1高表達(dá)組患者的5年無進(jìn)展生存率為36.2%，顯著低于PD-L1低表達(dá)組56.5%(log-rank=4.849，P=0.028)，PD-L1高表達(dá)組患者的5年生存率為44.9%，顯著低于PD-L1低表達(dá)組63.5%(log-rank=3.897，P=0.048)(見圖1)。

圖1 PD-L1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者5年無進(jìn)展生存率和總生存率的比較

三、單因素和多因素回歸分析影響NSCLC患者生存率的危險因素

經(jīng)單因素和多因素回歸分析顯示，腫瘤分期III-IV期、EGFR突變和PD-L1高表達(dá)為影響NSCLC患者生存率的獨(dú)立危險因素(見表2)。

表2 單因素和多因素回歸分析影響NSCLC患者生存率的危險因素

討 論

目前，越來越多的研究顯示PD-L1的表達(dá)情況與腫瘤的抑癌基因或致癌基因的突變狀態(tài)顯著相關(guān)。在NSCLC中尤其是肺腺癌，EGFR基因突變是最常見的突變類型，PD-L1的表達(dá)與EGFR基因突變密切相關(guān)[9-10]。Chen N等的研究報道顯示，通過激活EGFR信號通路可導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)水平上調(diào)，EGFR-TKIs不僅可直接減弱腫瘤細(xì)胞的生存能力，還可以通過下調(diào)PD-L1間接增強(qiáng)抗腫瘤免疫力[11]。同時NSCLC細(xì)胞系試驗證實，EGFR突變狀態(tài)與PD-L1表達(dá)情況顯著相關(guān)[12]。本文的實驗數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在132例患者中EGFR突變率27.3%(36/132)，其中PD-L1陽性患者20例，PD-L1陰性患者16例，PD-L1陽性表達(dá)與EGFR突變相關(guān)。本研究中PD-L1的陽性表達(dá)率為35.6%，明顯低于EL-GUINDY等研究NSCLC中PD-L1的陽性表達(dá)率65.5%[13]，而與Chen等研究1071例NSCLC患者PD-L1的陽性表達(dá)率33.7%的陽性率相當(dāng)[14]。結(jié)合本研究結(jié)果提示，對于PD-L1陽性表達(dá)和EGFR突變的NSCLC患者，采用EGFR-TKIs和PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療，可能會達(dá)到理想的臨床效果。

PD-L1是腫瘤細(xì)胞中檢測的關(guān)鍵免疫點(diǎn)，可與T細(xì)胞上的PD-1相結(jié)合，有效抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而使得癌細(xì)胞逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷[15]。已有多項研究顯示，PD-L1的表達(dá)與惡性腫瘤患者的生存率相關(guān)，包括腎癌、食管癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)、直腸癌等。但是，PD-L1的表達(dá)情況與NSCLC患者臨床預(yù)后的相關(guān)性還有一定的爭議，有研究表明，PD-L1表達(dá)陽性的NSCLC患者的OS低于PD-L1陰性表達(dá)患者[16]。另外還有研究顯示，PD-L1高表達(dá)NSCLC患者預(yù)后更佳[17]。本文的研究結(jié)果顯示PD-L1高表達(dá)NSCLC患者的無進(jìn)展生存率和總生存率均低于PD-L1低表達(dá)患者。多因素回歸分析表明，腫瘤分期III-IV期、EGFR突變和PD-L1高表達(dá)為NSCLC患者生存率的獨(dú)立危險因素。PD-L1的高表達(dá)伴有EGFR突變可能為患者接受EGFR-TKIs治療的潛在預(yù)測指標(biāo)。綜上所述，PD-L1在NSCLC患者中表達(dá)水平升高，與患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、EGFR突變密切相關(guān)。PD-L1高表達(dá)和EGFR突變?yōu)橛绊懟颊?年生存率的獨(dú)立危險因素，EGFR-TKIs和PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療可能為一種有效的聯(lián)合治療方案。