魏明莉 何森 陽(yáng)欽 畢煜玲 黃娜

肺癌是發(fā)病率和死亡率位居全球最高的惡性腫瘤[1]。肺腺癌是肺癌最常見(jiàn)的病理類型，具有浸潤(rùn)性強(qiáng)、破壞性大的特征，早期即可侵犯血管、淋巴管，常在原發(fā)腫瘤引起癥狀前已發(fā)生轉(zhuǎn)移。大部分肺腺癌在確診時(shí)已處于中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，無(wú)法獲得理想療效，5年生存率約18%[2]。因此，進(jìn)一步尋找與肺腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)提高肺癌的整體療效，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和臨床價(jià)值[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，Opa相互作用蛋白5(Opa interacting protein 5，OIP5)在膀胱癌[4]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[5]、胃癌[6-7]、結(jié)直腸癌[6]、肝癌[8]、乳腺癌[9]、急性髓系白血病[10]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著致癌基因的作用。它可以作為 miRNA的靶基因參與細(xì)胞的侵襲、遷移等一系列的調(diào)控。研究報(bào)道OIP5在肺癌中呈現(xiàn)高表達(dá),與不良預(yù)后相關(guān)[11]，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。因此本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討沉默OIP5對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲的作用及可能機(jī)制。

資料與方法

一、材料

肺腺癌A549細(xì)胞株由成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購(gòu)置Invitrogen公司。Matrigel基質(zhì)膠、8μm transwell小室均購(gòu)置于美國(guó)Corning公司。BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)置碧云天生物技術(shù)有限公司。OIP5兔多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)Proteintech 公司，β-Actin兔多抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，E-Cadherin兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，Vimentin兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司。OIP5 siRNA、siRNA control質(zhì)粒由上海吉滿生物公司設(shè)計(jì)提供。

二、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

肺腺癌A549細(xì)胞用含有10% FBS和雙抗(100U/mL的青霉素及100μg/mL的鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到40%左右時(shí)進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染。OIP5 siRNA、siRNA control質(zhì)粒具體轉(zhuǎn)染操作按lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染 OIP5 siRNA的A549細(xì)胞,記為 OIP5 siRNA組，轉(zhuǎn)染siRNA control后的A549細(xì)胞記control siRNA組，未做任何處理的A549細(xì)胞記為A549組。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)OIP5蛋白水平

收取OIP5 siRNA組、control siRNA組、A549組中細(xì)胞各約1×106個(gè)，提取總蛋白。按照BCA蛋白濃度試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，10% SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠80V，分離膠120V，100V電壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入OIP5抗體(1 ∶1 000稀釋)，4℃過(guò)夜。次日TBST洗3次，每次10min，加入β-actin抗體(1 ∶1 000稀釋)室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10min，ECL顯色液顯影。美國(guó)Bio-Rad公司凝膠掃描成像系統(tǒng)成像。目的條帶采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。重復(fù)3次，取均值。

四、transwell檢測(cè)遷移及侵襲能力

transwell下室加入650uL含10%FBS的培養(yǎng)基，上室加入細(xì)胞懸液100uL，細(xì)胞含量約2×104個(gè)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，將transwell小室置于4%多聚甲醛溶液中，室溫固定20min，用0.1%的結(jié)晶紫染色10min，用棉簽輕柔擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，用PBS洗3次，每次洗5min，將小室風(fēng)干，在顯微鏡下取5個(gè)視野，分別計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)量，取其平均值，以檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞侵襲與遷移能力檢測(cè)的方法差不多，在檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力之前，將-20℃冰箱中的matrigel基質(zhì)膠，放置于4℃冰箱中解凍，用無(wú)血清培養(yǎng)基以1 ∶8的比例稀釋matrigel基質(zhì)膠，每小室加入45uL稀釋后matrigel基質(zhì)膠，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置約30min，待膠凝固，按遷移能力的步驟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

五、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)E-cadherin、Vimentin 蛋白水平

收取OIP5 siRNA組、control siRNA組、A549組中細(xì)胞各約1×106個(gè)，提取總蛋白。一抗(1 ∶1000)稀釋，采用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平，步驟同三。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、OIP5沉默肺腺癌A549中OIP5表達(dá)水平

各組細(xì)胞中OIP5蛋白表達(dá)水平(如圖1)所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與A549組相比，OIP5 siRNA組中的OIP5蛋白表達(dá)水平顯著下降(t=11.862，P<0.05)，control siRNA組中OIP5蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.118，P>0.05)。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)三組細(xì)胞OIP5蛋白表達(dá)水平

二、OIP5沉默抑制肺腺癌A549細(xì)胞遷移能力

transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖2)所示，OIP5 siRNA組細(xì)胞遷移能力明顯弱于control siRNA組、A549組(F=44.168,P<0.05)。而control siRNA組與A549組比較細(xì)胞遷移能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.981,P>0.05)。

圖2 OIP5沉默抑制A549細(xì)胞遷移能力(結(jié)晶紫染色×200)

三、OIP5沉默抑制肺腺癌A549細(xì)胞侵襲能力

transwell小室及matrigel基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖3)，OIP5 siRNA組細(xì)胞侵襲能力明顯弱于control siRNA組、A549組(F=37.883,P<0.05)。而control siRNA組與A549組比較細(xì)胞侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.713，P>0.05)。

圖3 OIP5沉默抑制A549細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色×200)

四、OIP5沉默抑制肺腺癌A549細(xì)胞EMT

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)OIP5 siRNA組、control siRNA組、A549組中E-cadherin和Vimentin表達(dá)。結(jié)果(如圖4)所示，與control siRNA組、A549組比較，OIP5 siRNA組中E-cadherin 蛋白表達(dá)明顯升高(F=39.787，P<0.05)，Vimentin蛋白表達(dá)明顯減少(F=40.164，P<0.05)。Control siRNA組、A549組之間比較，E-cadherin表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.834，P>0.05)，Vimentin表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.181，P>0.05)。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) OIP5沉默抑制A549細(xì)胞EMT

討 論

近年來(lái)，肺腺癌在基因靶向治療、腫瘤免疫治療方面有了突破性的進(jìn)展，但肺腺癌起病隱匿、進(jìn)展迅速，早期癥狀不典型，確診者多屬于晚期患者，其治愈率及生存率仍很低。因此，從分子水平上進(jìn)一步研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，是提高肺癌診療水平的當(dāng)務(wù)之急[12]。

OIP5屬于癌-睪丸抗原的腫瘤特異性抗原，是一種能夠與Opa蛋白相互作用的蛋白編碼基因，該基因位于15號(hào)染色體上[13]。OIP5表達(dá)水平的高低與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，研究表明，敲除OIP5基因可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，可見(jiàn)肝臟原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)減少[8]。敲除OIP5基因，膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移明顯受抑制[14]。OIP5表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，沉默OIP5表達(dá)，腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑制[15]。文獻(xiàn)報(bào)道，在肺癌和食管癌患者中OIP5蛋白陽(yáng)性患者的預(yù)后比陰性患者預(yù)后差[11]，提示OIP5可能作為一個(gè)癌基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是腫瘤死亡率高的主要原因，其中遷移、侵襲為轉(zhuǎn)移前提，受多種機(jī)制的調(diào)控。EMT在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著非常重要的角色，它可以增強(qiáng)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，被認(rèn)為是腫瘤早期擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件[16-18]。EMT主要表現(xiàn)為E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等上皮標(biāo)記物的表達(dá)下調(diào)，而波形蛋白(Vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、纖連蛋白(Fibronectin)等間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去了它的極性，細(xì)胞之間的連接減少，形態(tài)接近于成纖維細(xì)胞，其粘附力下降、運(yùn)動(dòng)及遷移能力增強(qiáng)[19]。Zheng等[20]研究表明，OIP5通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路促細(xì)胞EMT，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而下調(diào)OIP5表達(dá)，則明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的EMT、遷移和侵襲。本研究利用RNA干擾技術(shù)沉默肺腺癌A549細(xì)胞中OIP5表達(dá)，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)A549細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin表達(dá)，結(jié)果顯示沉默OIP5能明顯上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，而降低Vimentin的表達(dá)，提示沉默OIP5抑制肺腺癌A549細(xì)胞EMT的發(fā)生；transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默OIP5表達(dá)后，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，說(shuō)明沉默OIP5抑制了A549細(xì)胞遷移、侵襲能力。

綜上所述，沉默 OIP5的表達(dá)可抑制A549細(xì)胞遷移、侵襲能力，抑制細(xì)胞EMT。OIP5可能通過(guò)抑制肺腺癌EMT而抑制其遷移、侵襲能力，這為臨床肺腺癌診治提供新思路，OIP5有望為成為肺腺癌治療的新分子靶點(diǎn)。目前有關(guān)OIP5在肺癌遷移侵襲中所起的作用研究報(bào)道很少，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。