梁春聯(lián) 章琳 李秀麗

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種進(jìn)行性且致死性的慢性肺疾病，患者常出現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞損傷，成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)明顯沉積的特征，但其病因尚不明確[1]。IPF患者中位生存期僅有2-3年[2]，并且流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)IPF發(fā)病率逐年增加[3]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類保守的19-22堿基長(zhǎng)度的非編碼RNA，可以結(jié)合于靶基因的3’UTR端，抑制靶基因的翻譯或者促進(jìn)mRNA降解。大量研究表明miRNAs在許多疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著重要意義。研究表明，MiR-153參與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生，如帕金森病和阿爾茨海默病[4]。并且Liang等人[5]發(fā)現(xiàn)miR-153通過(guò)靶向抑制TGFBR-2表達(dá)，在特發(fā)性肺纖維中具有抗纖維化。另外，miR-153通過(guò)靶向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SNAII參與人類上皮癌EMT過(guò)程。而肺上皮細(xì)胞EMT過(guò)程與肺纖維化發(fā)生密切相關(guān)[6]。但miR-153與SNAI1在IPF中的相互作用機(jī)制及對(duì)IPF發(fā)生發(fā)展的影響尚未見(jiàn)明確報(bào)道。

資料與方法

一、IPF病人

所有患者(n=22)經(jīng)臨床、影像學(xué)和特征性組織病理學(xué)特征，并符合美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)會(huì)共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)(American Thoracic Society/European Respiratory Society)[7]。并根據(jù)患者的年齡以及性別選擇健康志愿者(n=22)，從所有參與者體內(nèi)采集5mL血液樣本用于后續(xù)檢測(cè)。本研究中所有參與者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)，并且經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)該項(xiàng)研究。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5以及HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。CM7-1培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)用于培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，并補(bǔ)充10%胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)。HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM，同樣補(bǔ)充10%胎牛血清。所有細(xì)胞培養(yǎng)條件為5% CO2，37℃。

三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，將MRC-5細(xì)胞接種到六孔板中，使得細(xì)胞密度為3×105mL-1。采用Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，按照說(shuō)明書(shū)指示向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-153,miR-153 inhibitor，pc-DNA3.1-SNAI1,miR-153+pc-DNA3.1-SNA1以及相應(yīng)的陰性對(duì)照。

四、免疫印跡(western blot)分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，采用PBS緩沖液洗滌，向六孔板中加入150 μl/孔 的RIPA溶液(含有1mmol/L PMSF)。4℃條件下9 000rpm/min離心5min，收集上清液。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度后，40μg蛋白提取液用于十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移PVDF膜上，TBST洗滌后加入脫脂牛奶，于4℃條件下封閉2h。之后加入待檢測(cè)蛋白對(duì)應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜，隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗于37℃孵育1h。采用ECI plus分析蛋白表達(dá)水平，并以GADPH作為內(nèi)參。本實(shí)驗(yàn)中所有抗體購(gòu)自Abcam公司。

五、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)

采用Trizol 試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取細(xì)胞或血液中總RNAs，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScript Reverse Transcription Kit,德國(guó)Qiagen公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用IQ SYBR Green Supermix(美國(guó)Bio-Rad)進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)所用引物如下：miR-153: 5′-TTCCTTTGATTGCATAGTCACAA-3′(Forward)/5′-CCTCCACACACTCACCTCATC-3′(Reverse)；U6 snRNA: 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′(Forward)/5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′(Reverse)；SNAI1: 5′-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3′(Forward)/5′-ATCTCCGGAGGTGGGATG-3′(Reverse)；GAPDH：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′(Forward)/5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′(Reverse)。其中GAPDH作為mRNA內(nèi)參基因，U6 snRNA作為miRNA內(nèi)參基因。每個(gè)樣本檢測(cè)重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，采用△△Ct法進(jìn)行定量。

六、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將預(yù)測(cè)的miR-153與SNAI1相互作用的3’UTR序列(野生型和突變型)克隆至psiCHECK-2 載體，位于海腎熒光素酶開(kāi)放閱讀框下游構(gòu)建為報(bào)告質(zhì)粒，命名為SNAI1-WT(野生型)與SNAI1-MUT(突變型)。將HEK-293T細(xì)胞按照5×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板中。按照操作說(shuō)明書(shū)，采用LipofectAMINETM 2000將miR-153、SNAI1-WT與SNAI1-MUT及內(nèi)參質(zhì)粒SV40轉(zhuǎn)染到HEK-23T細(xì)胞中。24h后，采用雙熒光素酶試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

七、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

一、miR-153及SNAI1的差異表達(dá)

檢測(cè)IPF患者和健康志愿者體內(nèi)miR-153以及SNAI1 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果(見(jiàn)圖1)所示。相對(duì)于健康志愿者，miR-153在患者體內(nèi)顯著低表達(dá)(t=4.891，P<0.01),而SNAI1顯著高表達(dá)(t=5.791，P<0.01)。

圖1 miR-153及SNAI1表達(dá)水平

二、miR-153抑制纖維化

向MRC-5細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-153 mimics、inhibitors以及scramble 序列(作為NC)，檢測(cè)細(xì)胞中α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)以及纖連蛋白(Fibronectin)的表達(dá)水平。結(jié)果(見(jiàn)圖2)所示，轉(zhuǎn)染miR-153 mimics 顯著抑制上述四種蛋白表達(dá)(F=32.06，P<0.01)，而轉(zhuǎn)染 miR-153 inhibitors則顯著促進(jìn)上述四種蛋白高表達(dá)(F=24.11，P<0.01)。

圖2 miR-153對(duì)纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)影響

三、miR-153調(diào)控SNAI1

有研究表明miR-153靶向SNAI1，抑制SNAI1表達(dá)。本研究采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-153與SNAI1之間的靶向關(guān)系，結(jié)果(見(jiàn)圖3)所示。圖3A表明SNAI1突變后，miR-153轉(zhuǎn)染不影響熒光素酶活力，而野生型SNAI1組熒光素酶活力受miR-153顯著抑制(t=8.125，P<0.01)。另外圖3B-D進(jìn)一步表明轉(zhuǎn)染miR-153顯著抑制SNAI1 mRNA(F=16.26，P<0.01)以及蛋白表達(dá).(F=27.68，P<0.01)。

圖3 miR-153與SNAI1靶向關(guān)系

四、miR-153通過(guò)SNAI1抑制纖維化

為了進(jìn)一步證明miR-153通過(guò)抑制SNAI1表達(dá)的抗纖維化作用，本研究向MCR-5細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-SNAI1以及轉(zhuǎn)染miR-153 mimics+pc-DNA3.1-SNAI1，檢測(cè)細(xì)胞中纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平，結(jié)果(見(jiàn)圖4)所示。過(guò)表達(dá)SNAI1(pc-DNA3.1-SNAI1組)顯著促進(jìn)α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin表達(dá)。但轉(zhuǎn)染miR-153 mimics后，四種蛋白的表達(dá)水平被抑制。

圖4 miR-153靶向SNAI1對(duì)纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)影響

討 論

IPF是復(fù)雜的肺間質(zhì)疾病，多種因素都可引發(fā)肺纖維化，但其具體的分子機(jī)制尚不明確。臨床上，IPF治療效果差，缺少特效藥。目前研究表明，EMT是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵過(guò)程[6]。EMT發(fā)生過(guò)程中，成熟的上皮細(xì)胞逐漸失去其原有功能，成為間充質(zhì)細(xì)胞，并且α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin等纖維細(xì)胞特異蛋白表達(dá)水平顯著升高[8]。在此過(guò)程中TGF-β信號(hào)通路的激活起到了關(guān)鍵作用，在TGF-β1誘導(dǎo)下，人肺泡上皮細(xì)胞中的α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin等蛋白表達(dá)顯著增加[9]。TGF-β1可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的SNAI1以及SNAI2蛋白表達(dá)，導(dǎo)致E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)抑制[10]。因此，SNAI1在IPF發(fā)生過(guò)程中具有扮演著重要角色。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SNAI1在IPF患者體內(nèi)顯著高表達(dá)，因此，我們猜測(cè)調(diào)控SNAI1表達(dá)或許可以抑制IPF的發(fā)生和發(fā)展。

以往的研究表明miR-153具有抗肺纖維化作用，Liang等人發(fā)現(xiàn)miR-153調(diào)控TGFBR-2表達(dá)，從而降低人肺纖維細(xì)胞MRC中Fibronectin等蛋白的表達(dá)[5]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)miR-153在IPF患者體內(nèi)顯著低表達(dá)。并且轉(zhuǎn)染miR-153 mimics會(huì)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞中的纖維特異蛋白表達(dá)抑制，而轉(zhuǎn)染miR-153 inhibitors導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)。并且多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，miR-153在腫瘤細(xì)胞中可以調(diào)控SNAI1，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及增殖[11-13]。而Xia等人發(fā)現(xiàn)miR-153可以通過(guò)調(diào)控SNAI1抑制肝癌細(xì)胞的EMT過(guò)程[14]。但miR-153與SNAI1在IPF中的相關(guān)調(diào)控機(jī)制及其作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)以及轉(zhuǎn)染miR-153 mimics和inhibitors驗(yàn)證了miR-153抑制SNAI1表達(dá)(見(jiàn)圖3)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了轉(zhuǎn)染miR-153抑制α-SMA，Vimentin，Collagen Ⅰ以及Fibronectin等蛋白表達(dá)。

結(jié) 論

綜上所述，本研究表明，調(diào)控SNAI1的miR-153具有抗纖維化作用。然而，IPF患者中miR-153的失調(diào)和miR-153的治療價(jià)值需要進(jìn)一步研究。