張潔云 張明霞 陳騎 鄧國防 鄧群益 陳濤 楊倩婷

2018年，世界范圍內(nèi)有超過1000萬例新發(fā)結(jié)核病患者，其中超過100萬例患者死亡[1](說明：WHO未出版《2020年全球結(jié)核病報告》，因此2019年全球結(jié)核病的疫情情況未知)，造成結(jié)核病流行的因素眾多，其中缺乏特異、有效的結(jié)核病早期診斷技術(shù)是重要的原因之一[2]?；颊卟荒鼙辉缙诎l(fā)現(xiàn)和診斷，會導(dǎo)致延誤治療時間，增加治療費用和病死率；菌陰結(jié)核病患者或肺外結(jié)核病人由于缺乏病原學(xué)證據(jù)或肺部癥狀，在臨床上診斷更加困難。目前，困擾結(jié)核病早期診斷最突出的問題是缺乏特異性的標(biāo)志物[3]。很多國家的研究者都在致力于尋找用于活動性結(jié)核病診斷的新的生物標(biāo)志[4-5]。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測外周血CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平，評價CD3+CD161+淋巴細(xì)胞在菌陽和菌陰結(jié)核病患者中的診斷效能。

資料與方法

一、資料收集

1 研究對象

前瞻性選擇2015年1月1日至2017年12月30日深圳市第三人民醫(yī)院收治的127例(名)結(jié)核病患者或健康人。本研究收集的標(biāo)本均經(jīng)過醫(yī)院機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號：2014012)。所有研究對象均簽署知情同意書。

2 排除標(biāo)準(zhǔn)

排除HIV感染、妊娠婦女、使用免疫抑制劑或增強劑治療、嚴(yán)重肝腎功能衰竭、有陳舊性結(jié)核病病灶者。

3 分組情況

結(jié)核病患者根據(jù)診斷和檢查情況分為菌陽結(jié)核病患者(簡稱“菌陽組”)和菌陰結(jié)核病患者(簡稱“菌陰組”)；潛伏性結(jié)核感染者(簡稱“潛伏感染組”)和健康對照者(簡稱“對照組”)來源于本院健康體檢人群。每組患者納入數(shù)量根據(jù)研究需要設(shè)定，達(dá)到數(shù)量后即停止納入。

1)菌陽組：共40例。其中，男28例(占70%)，女12例(占30%)；年齡17～79歲，平均(42.22±2.94)歲。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[6]納入患者，接受正規(guī)抗結(jié)核藥物治療。結(jié)核病患者痰培養(yǎng)為陽性或痰涂片為陽性。

2)菌陰組：共37例。其中，男30例(占81%)，女7例(占19%)；年齡19～75歲，平均(42.41±2.52)歲。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[6]納入患者，接受正規(guī)抗結(jié)核藥物治療。結(jié)核病患者痰培養(yǎng)為陰性或連續(xù)3次痰涂片均為陰性；診斷依據(jù)為有典型的結(jié)核病相關(guān)臨床表現(xiàn)，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)典型結(jié)核病表現(xiàn)，且抗結(jié)核藥物治療有效。

3)潛伏感染組：共20例，男16例(占80%)，女4例(占20%)；年齡24～79歲，平均(44.50±2.60)歲。有明確的活動性肺結(jié)核接觸史，結(jié)核分枝桿菌γ干擾素釋放試驗(IGRA)陽性，無臨床癥狀，胸部X線攝影(簡稱“胸片”)正常，體檢健康。

4)對照組：共30例，男17例(占57%)，女13例(占43%)；年齡20～60歲，平均(39.17±1.92)歲。無明確活動性肺結(jié)核接觸史，IGRA檢測陰性，無臨床癥狀，胸片正常，經(jīng)體檢證實為健康者。

二、研究方法

收集各組人群新鮮的全血200 μl，用紅細(xì)胞裂解液(美國BD Bioscience公司)將紅細(xì)胞裂解，離心后收集細(xì)胞。細(xì)胞用小鼠抗人CD3(美國BD Bioscience公司；克隆號：SY7)和抗CD161(美國BioLegend公司；克隆號：HP-3G10)等抗體進(jìn)行表面染色，室溫避光孵育15 min后，裂解紅細(xì)胞后將樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍并進(jìn)行流式分析。采用BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD Bioscience公司)進(jìn)行檢測，并使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。收集的樣本在24 h內(nèi)完成處理和檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平

采用流式細(xì)胞儀分別檢測各組人群外周血CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平(圖1)。對照組、潛伏感染組、菌陰組和菌陽組CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平分別為(30.05±1.27)%、(26.88±1.30)%、(16.89±0.83)%和(17.59±1.36)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.77，P<0.0001)。四組間進(jìn)行兩兩比較，除對照組與潛伏感染組(P>0.05)、菌陰組與菌陽組(P>0.05)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義外；對照組與菌陽組、對照組與菌陰組、潛伏感染組與菌陽組、潛伏感染組與菌陰組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)。

圖1 不同組別人群CD3+CD161+ 淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平

二、CD3+CD161+淋巴細(xì)胞表達(dá)水平診斷結(jié)核病的效能

通過繪制ROC曲線評價CD3+CD161+淋巴細(xì)胞診斷結(jié)核病患者的效能。當(dāng)在分辨對健康照組和菌陰組時曲線下面積(AUC)為0.932，當(dāng)取閾值<76.51%時(即當(dāng)CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)比例低于76.51%時，可判斷為結(jié)核病患者)，其敏感度為80.49%(95%CI=65.13%～91.18%)，特異度為90.00%(95%CI=73.47%～97.89%)。當(dāng)在分辨對健康照組和菌陽組時AUC為0.914，當(dāng)取閾值<82.86%時(即當(dāng)CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)比例低于82.86%時，可判斷為結(jié)核病患者)，其敏感度為86.49%(95%CI=71.23%～95.46%)，特異度為90.00%(95%CI=73.47%～97.89%)。當(dāng)在分辨潛伏感染組和菌陰組時AUC為0.888，當(dāng)取閾值<74.49%時(即當(dāng)CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)比例低于74.49%時，可判斷為結(jié)核病患者)，其敏感度為80.49%(95%CI=65.13%～91.18%)，特異度為89.47%(95%CI=66.86%～98.70%)。當(dāng)在分辨潛伏感染組和菌陽組時AUC為0.865，當(dāng)取閾值<74.98%時(即當(dāng)CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)比例低于74.98%時，可判斷為結(jié)核病患者)，其敏感度為83.78%(95%CI=67.99%～93.81%)，特異度為89.47%(95%CI=66.86%～98.70%)(見圖2)。

圖2 繪制ROC曲線評價CD3+CD161+在分辨菌陽結(jié)核

上述結(jié)果顯示，各組ROC的AUC均在0.85以上，提示本研究中CD3+CD161+淋巴細(xì)胞在分辨結(jié)核病患者時效能較好。另外，CD3+CD161+淋巴細(xì)胞在分辨菌陰和菌陽患者的效能基本相似(見表1)。

表1 ROC曲線評價CD3+CD161+淋巴細(xì)胞在分辨菌陽結(jié)核病和菌陰結(jié)核病的效能

討 論

目前國內(nèi)實驗室診斷結(jié)核病的診斷方法主要有兩類：微生物學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測[7-8]。前者包括痰或組織標(biāo)本找抗酸桿菌、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和PCR核酸檢測；后者有抗體和細(xì)胞免疫檢測，細(xì)胞免疫檢查包括PPD皮膚試驗和IGRA技術(shù)[9]。PPD皮膚試驗是目前檢測結(jié)核分枝桿菌感染最常用的細(xì)胞免疫檢查方法，雖然操作簡單，但患者需要在皮膚試驗后72 h查驗，最主要的是PPD皮膚試驗所用抗原與卡介苗(BCG)存在交叉反應(yīng)，無法區(qū)分BCG免疫反應(yīng)和結(jié)核分枝桿菌感染[10]。利用免疫學(xué)檢測目前最好的檢測方法是IGRA技術(shù)，其敏感度是現(xiàn)有的診斷技術(shù)中最高的。然而，IGRA檢測無法有效區(qū)分活動性結(jié)核病與潛伏性結(jié)核感染。對于我國這樣的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染率較高的地區(qū)，IGRA的診斷效率因此變得有限[11]。因此，尋找新的結(jié)核免疫診斷標(biāo)志物非常有必要[12]。

本研究通過檢測T淋巴細(xì)胞表面CD161的表達(dá)，評價其在結(jié)核病診斷中的價值。CD161+是在人類NK細(xì)胞和各種T淋巴細(xì)胞亞群上表達(dá)的C型凝集素樣受體[13], 并且還是黏膜相關(guān)不變T(mucosal-associated invariant T, MAIT)細(xì)胞主要表達(dá)的標(biāo)志物[14]。Coulter F等發(fā)現(xiàn)，活動性肺結(jié)核病人的外周血CD4+CD161+Vα7.2+ MAIT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IFN-γ水平比潛伏感染者的低[15]，動物實驗表明，感染結(jié)核桿菌后的個體血液中的MAIT細(xì)胞頻率下降[16]，有學(xué)者認(rèn)為在活動性結(jié)核期間外周血的MAIT細(xì)胞減少是因為在其在肺或其他感染部位富集[17]。CD3+CD161+在結(jié)核菌感染中的作用鮮有研究，早期研究表明，大多數(shù)Th17細(xì)胞亞群高表達(dá)CD161[18],Th17細(xì)胞能夠介導(dǎo)抗微生物和促炎反應(yīng)在抗結(jié)核感染中具有重要作用[19],Th17細(xì)胞在活動性肺結(jié)核病患者外周血中的表達(dá)是明顯降低的[8-9,15]，另一項研究表明，活動性肺結(jié)核病人的外周血CD4+CD161+明顯減少[20]，筆者推測CD3+CD161+可能在結(jié)核病的診斷中具有一定的價值，因此首先檢測外周血中CD3+T淋巴細(xì)胞中的CD161+比例。在研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者外周血T淋巴細(xì)胞的CD161+表達(dá)水平明顯低于對照組和潛伏感染組，這與Jiang等[21]的研究結(jié)果一致，雖然目前并不清楚結(jié)核感染為何會導(dǎo)致CD3+CD161+淋巴細(xì)胞下降，但是有研究表明[22]可能是由于病原體的感染誘導(dǎo)更多CD161+淋巴細(xì)胞的凋亡。但本研究結(jié)果提示CD3+CD161+的表達(dá)與結(jié)核病發(fā)生有關(guān)，并且可以有效區(qū)分健康人群和結(jié)核病患者，可作為結(jié)核病診斷的標(biāo)志物。

另外，目前臨床上診斷結(jié)核病患者的金標(biāo)準(zhǔn)是微生物檢測結(jié)果，確診的陽性率非常低，因此大部分結(jié)核病患者被診斷為菌陰結(jié)核病。為此，本研究比較了菌陽和菌陰結(jié)核病患者CD3+CD161+淋巴細(xì)胞表達(dá)的差異，從而了解CD161+在菌陰結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值，發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)核病患者的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示CD3+CD161+在臨床上能用于診斷肺外結(jié)核病患者(大部分為菌陰結(jié)核病患者)和無病原學(xué)證據(jù)的肺結(jié)核病人。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CD3+CD161+T淋巴細(xì)胞在診斷菌陽患者和菌陰患者的敏感度和特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在分辨菌陽組與對照組和潛伏感染組時，兩者兩組AUC均達(dá)到0.85以上，敏感度高于80%，特異度高于90%。CD3+CD161+T淋巴細(xì)胞在分辨菌陰組和對照組或潛伏感染組時效能相似。本研究結(jié)果驗證了CD3+CD161+T淋巴細(xì)胞水平對結(jié)核病患者的診斷效能，提示CD161+能作為診斷結(jié)核病的有效指標(biāo)之一。

因本研究只是探索性試驗，目的是初步了解CD3+CD161+淋巴細(xì)胞在不同人群中表達(dá)水平的差異，未根據(jù)臨床研究進(jìn)行預(yù)設(shè)樣本量，也未對不同組別人群的性別和年齡進(jìn)行可比性比較。下一步的研究將通過擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步評價和驗證CD3+CD161+淋巴細(xì)胞表達(dá)水平在臨床應(yīng)用中的價值。

綜上，本研究通過利用流式細(xì)胞儀檢測CD161+的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)核病患者CD3+CD161+淋巴細(xì)胞的表達(dá)明顯降低，同時發(fā)現(xiàn)菌陰結(jié)核病患者和菌陽結(jié)核病患者CD3+CD161+淋巴細(xì)胞表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，該指標(biāo)對診斷菌陰和菌陽結(jié)核病患者的效能相似。CD3+CD161+淋巴細(xì)胞可以作為診斷菌陰結(jié)核病患者的候選分子標(biāo)志物。