李挺云 梁培育 王聲興 周治彥 陳金火

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，海南 ?？?570102)

前列腺癌(PC)是男性中發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，研究顯示我國PC發(fā)病率及致死率呈逐年增加的趨勢〔1〕。PC具有強侵襲性且嚴重威脅男性生命安全，目前放療是治療PC的有效手段，可提高患者生存質(zhì)量并改善患者預后，由于PC細胞及個體差異等因素導致不同前列腺癌患者對射線的反應不同進而導致治療效果不佳〔2〕。因而放射治療PC患者過程中提高放療敏感性對提高治療效果及改善患者預后均具有重要意義。有研究表明麥冬皂苷(OP)D作為麥冬提取物可通過蛋白激酶-1/混合系激酶域樣蛋白(RIP1/MLKL)信號通路進而抑制PC細胞增殖，具有較強的抗腫瘤作用〔3〕；還有研究顯示OP可抑制非小細胞肺癌細胞增殖以及調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白等作用〔4，5〕。OP-D、OP-B均是從麥冬中分離出的單體，但是目前關(guān)于麥冬提取物OP-B是否可抑制PC細胞增殖尚不明確。因此本研究主要探討OP-B對前列腺癌細胞放療敏感性的影響，并分析其是否通過抑制Notch1信號通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 PC-3細胞(貨號：BNCC100267)購自美國ATCC公司。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 OP-B(批號：20160908)購自南京普怡生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(批號：20160306)、胎牛血清(批號：20161109)均購自美國Gibco公司；胰酶(批號：20170907)購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；Notch1信號通路特異性阻斷劑(DAPT，批號：20170321)購自深圳市浩博世紀生物有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，批號：20161207)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；四甲基偶唑氮鹽(MTT，批號：20161003)、二甲基亞砜(DMSO，批號：20160908)均購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號：20170803)購自上海信裕生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(批號：20160903)購自上海博谷生物科技有限公司；兔抗人Notch1(批號：20170305)、Hes1抗體(批號：20170403)購自北京義翹神州科技有限公司；兔抗人Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax批號：20170201)、B細胞淋巴瘤(Bcl-2，批號：20170405)抗體均購自美國Abcam公司；兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3，批號：20161105)、裂解的多聚ADP核糖聚合酶(cleaved PARP)抗體(批號：20170105)均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(批號：20170406)購自美國CST公司；蛋白裂解液(RIPA，批號：20170503)購自青島捷世康生物科技有限公司；電化學發(fā)光(ECL)液(批號：20170613)購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫染料(批號：20170728)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；F20型透射電鏡購自美國FEI公司；DxFLEX型流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Trans-Blot Turbo transfer system快速轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國伯樂公司；Smart View Pro2000型凝膠成像系統(tǒng)購自Major Science公司；Synergy2多功能酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；TEM-SN型透射電鏡購自上海納騰儀器有限公司。

1.2.2細胞培養(yǎng)、處理及分組 PC-3細胞放入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱(37℃ 5%CO2、95%濕度)內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合度至80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。將PC-3細胞分為5組：空白對照組：X射線照射后不進行任何處理的PC-3細胞；陽性對照組：以DAPT處理PC-3細胞；低劑量組：PC-3細胞中加入2.5 μmol/L OP-B；中劑量組：PC-3細胞中加入5 μmol/L OP-B；高劑量組：PC-3細胞中加入10 μmol/L OP-B〔6〕。所有細胞采用X射線照射，放射劑量率為2.0 Gy/min，每組細胞平均分成5份，每份只經(jīng)0、2、4、6、8 Gy其中一種輻射處理〔7〕，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)研究。

1.2.3MTT實驗檢測PC-3細胞增殖 放射處理后的各組細胞經(jīng)胰酶消化，接種至96孔板(2.5×104個/孔)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用MTT實驗檢測PC-3細胞增殖，分別加入5 g/L MTT(20 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，分別加入DMSO(150 μl/孔)，放入搖床上振蕩5 min，使用多功能酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值，計算細胞增殖率=實驗組/空白組×100%。

1.2.4檢測LDH漏出率〔8〕收集各組PC-3細胞，接種于96孔板(2.5×104/孔)，同時以DMEM培養(yǎng)基為細胞自然釋放對照組，以0.8% Triton X-100為最大釋放對照組，每組5個生物學重復，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其中最大釋放孔需在培養(yǎng)結(jié)束前加入0.8% Triton X-100(時間45 min)，分別向酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)板內(nèi)加入100 μl上清，室溫孵育10 min，分別加入LDH底物溶液(100 μl)，避光孵育15 min，分別加入30 μl檸檬酸終止液(1 mol/L)，采用多功能酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值，LDH漏出率(%)=(實驗組吸光度值-自然釋放對照組吸光度值)/(最大釋放對照組吸光度值-自然釋放對照組吸光度值)×100%。

1.2.5流式細胞儀檢測PC-3細胞凋亡 綜合1.2.3實驗結(jié)果選取PC-3細胞增殖率為50%左右的輻射劑量進行后續(xù)研究。收集各組PC-3細胞，胰酶消化后接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，5 Gy輻射處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，胰酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化，收集細胞，加入PBS制備細胞懸液，加入結(jié)合緩沖液(500 μl)重懸細胞，分別加入FITC標記的Annexin V(5 μl)、PI(5 μl)，室溫孵育15 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡并計算細胞凋亡率，細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)目/細胞總數(shù)×100%。

1.2.6Western印跡法檢測Notch1、Hes1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白表達 收集各組PC-3細胞，胰酶消化，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后收集細胞，加入RIPA重懸細胞，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，參照BCA試劑盒說明書操作檢測蛋白濃度與純度，取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，10%)反應，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入脫脂牛奶(5%)封閉室溫孵育2 h，分別加入Notch1、Hes1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP一抗，稀釋比均為1∶500，置于4℃冰箱內(nèi)保存過夜，次日加入稀釋比為1∶5 000的二抗，ECL顯影，各蛋白均以β-actin為內(nèi)參基因，并采用Image J軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白積分吸光度值/β-actin積分吸光度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1OP-B對PC-3細胞增殖的影響 隨著輻射劑量的增加PC-3細胞增殖逐漸降低，同一輻射條件下，與空白對照組相比，陽性對照組及OP-B中、高劑量組PC-3細胞增殖率顯著降低(P<0.05)；與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組與陽性對照組均顯著降低(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組相比無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 OP-B對PC-3細胞增殖的影響

2.2OP-B對PC-3細胞LDH漏出率的影響 隨著輻射劑量的增加PC-3細胞中LDH漏出率逐漸降低，同一條件下，與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細胞經(jīng)不同劑量電離輻射后LDH漏出率顯著降低(P<0.05)，與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組與陽性對照組均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 OP-B對PC-3細胞 LDH 漏出率的影響

2.3OP-B對PC-3細胞凋亡的影響 由于照射劑量為5 Gy時PC-3細胞增殖率為50%左右，因此選用5 Gy照射劑量處理各組PC-3細胞進行后續(xù)實驗研究。與空白對照組〔(16.13±2.15)%〕相比，低、中、高劑量組及陽性對照組PC-3細胞凋亡率顯著升高〔(41.51±2.37)%、(43.45±3.16)%、(79.75±2.24)%、(80.28±1.32)%，P<0.05〕，與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組與陽性對照組PC-3細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 OP-B對PC-3細胞凋亡的影響

2.4各組PC-3細胞Notch1、Hes1蛋白表達比較 與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細胞中Notch1、Hes1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組均顯著低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組相比無明顯差異性(P>0.05)，見圖2、表3。

2.5OP-B對PC-3細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細胞中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白表達均顯著升高(均P<0.05)，高劑量組與陽性對照組均顯著高于低劑量組、中劑量組(均P<0.05)；與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細胞中Bcl-2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組均顯著低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組相比無明顯差異性(P>0.05)，見表3、圖3。

1～5：空白對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，下圖同圖2 各組PC-3細胞Notch1、Hes1蛋白表達

表3 各組PC-3細胞Notch1、Hes1蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達比較

圖3 OP-B對PC-3細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

Notch通路可參與細胞增殖、分化及凋亡等多種生物學過程，通過抑制Notch通路及其受體表達可抑制PC細胞增殖、侵襲，同時可抑制PC細胞中蛋白激酶B(AKT)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等細胞通路〔9，10〕。推測針對Notch信號通路的靶向藥物可增強PC患者放療敏感性。

OP-B可通過抑制AKT/mTOR信號通路進而促使肝癌細胞發(fā)生自噬進而誘導癌細胞凋亡，通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)/c-Jun信號通路進而誘導結(jié)腸癌細胞、胃癌細胞自噬及凋亡〔11～13〕。OP-B可通過激活肺癌細胞自噬進而增強腫瘤細胞凋亡敏感性〔14〕，影響不同信號通路誘導癌細胞凋亡，但對Notch1/Hes信號通路在PC細胞中的研究卻未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。研究表明二甲雙胍可通過抑制Notch1/Hes信號通路進而抑制PC-3細胞增殖并促使其凋亡〔15〕。本研究說明OP-B可抑制PC-3細胞增殖。LDH漏出率與癌細胞增殖密切相關(guān)，LDH漏出率降低時表明宮頸癌細胞增殖受到抑制，宮頸癌細胞對電離輻射的敏感性增加〔7〕。本研究說明OP-B可抑制PC-3細胞增殖并提高PC-3細胞對電離輻射的敏感性。高劑量OP-B可增強電離輻射介導的PC-3細胞凋亡并增強其放療敏感性。Notch信號通路可調(diào)控多種腫瘤細胞分化及遷移等過程，其中Notch受體Notch1與配體結(jié)合后可激活Notch信號通路進而激活下游靶基因Hes1表達〔16，17〕。Notch1及其下游靶基因Hes1在前列腺癌中呈高表達，抑制其表達可明顯抑制癌細胞增殖并促進其凋亡，研究發(fā)現(xiàn)抑制Notch1信號通路可增強乳腺癌放療敏感性〔18，19〕。本研究提示OP-B與Notch1信號通路抑制劑的作用相同。電離輻射可殺死腫瘤細胞，其可能作用機制為激活細胞凋亡通路進而誘導細胞壞死，若凋亡相關(guān)蛋白表達異?；蛉笔Э纱偈蛊鋵ν饨绱碳さ拿舾行越档瓦M而產(chǎn)生抗性〔20〕。Caspase家族在細胞凋亡等信號通路中發(fā)揮重要作用，其中抗凋亡蛋白Bcl-2與促細胞凋亡蛋白Bax比例失衡可引起聯(lián)級反應并激活Caspase通路促進Caspase-3、PARP表達進而促使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解導致細胞凋亡〔21〕。本研究提示高劑量OP-B可通過激活細胞凋亡通路并促使細胞凋亡進而增強PC-3細胞對放療的敏感性。