唐書福 趙建軍 張建勇 肖雯雯 張紅

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科呼吸二病區(qū)，貴州 遵義 563000)

急性肺損傷(ALI)或其更加嚴(yán)重的階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由多種因素(包括肺內(nèi)和肺外直接或間接病因等)導(dǎo)致的，肺的組織病理學(xué)主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞受到損傷引起的非心源性肺水腫〔1，2〕。ALI/ARDS起病急、進(jìn)展快，死亡率高達(dá)30%～50%〔3，4〕。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)機(jī)制是ALI重要致病機(jī)制，而水通道蛋白(AQPs)與ALI肺水腫的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系密切〔5〕。另有研究報(bào)道，內(nèi)毒素對(duì)AQPs的調(diào)控作用主要通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路中的c-Jun氨基端蛋白激酶(JNK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)兩條途徑完成〔6〕。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)作為具有抗炎作用的一種新型抗炎介質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道其具有減輕ALI肺水腫的作用。在ALI肺水腫中AQP1與JNK信號(hào)傳導(dǎo)間的關(guān)系尚未完全明確。本研究旨在探討靜脈注射藥物CGRP對(duì)ALI大鼠肺組織AQP1及磷酸化(P)-JNK表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠(n=42，體重178～225 g)購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將42只大鼠隨機(jī)分為NS對(duì)照組(NS組，n=7)、CGRP對(duì)照組(CGRP組，n=7)、急性肺損傷組(ALI組，n=14)和干預(yù)組(Control組，n=14)共四個(gè)大組，其中ALI組分為6 h ALI組和12 h ALI組兩個(gè)亞組(各亞組n=7)，Control組分為6 h Control和12 h Control組兩個(gè)亞組(各亞組n=7)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)藥物 本實(shí)驗(yàn)中主要試劑脂多糖(LPS)、CGRP試劑和小鼠AQP1單克隆抗體分別購(gòu)于Sigma、Tocris和abcam公司，p-JNK1/2多克隆抗體、GAPDH于美國(guó)Affinity公司購(gòu)買。

1.3構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?本研究中按LPS以10 mg/kg以尾靜脈注射建立ALI組大鼠模型，分別在6 h和12 h取標(biāo)本；Control組按5 μg/kg尾靜脈注射藥物CGRP，成功注射CGRP后1 h按10 mg/kg尾靜脈注射LPS，分別于6 h和12 h取材；CGRP組按5 μg/kg尾靜脈注CGRP后6 h取標(biāo)本；NS組按0.2 ml(1 ml/kg)尾靜脈注射NS后6 h取標(biāo)本。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù) 收集各組SD大鼠的BALF，取10 μl的標(biāo)本滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)；取離心后的BALF沉淀20 μl涂片(2～3張/標(biāo)本)，待晾干玻片后進(jìn)行姬姆薩染色，在油鏡下(單盲法)計(jì)數(shù) 200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出細(xì)胞數(shù)。

1.4.2肺組織濕/干重比值(W/D) 取各組大鼠右上葉肺標(biāo)本，用濾紙將其表面血液和水分吸干盡，電子天平稱肺組織重量，計(jì)為濕重(W)；后將其置于80℃烤箱中烘烤48 h后稱肺組織重量，計(jì)為干重(D)，計(jì)算出各組大鼠肺組織標(biāo)本W(wǎng)/D值。

1.4.3免疫組化(IHC)法測(cè)定各組大鼠肺組織AQP1和p-JNK蛋白表達(dá)水平 本實(shí)驗(yàn)按IHC試劑盒說明，采用IHC方法(二步法)，觀察AQP1和p-JNK蛋白表達(dá)。各組肺組織石蠟切片標(biāo)本脫蠟、脫水后，熱修復(fù)抗原，山羊血清封閉非特異性抗原，依次滴加入一抗、二抗和卵白素-生物素-酶復(fù)合物(ABC)復(fù)合物，然后使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后進(jìn)行脫水和中性樹膠封片等處理。用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗設(shè)為空白對(duì)照，呈現(xiàn)棕黃色的顆粒者為陽性。

1.4.4Western印跡檢測(cè)AQP1和p-JNK蛋白水平 稱量20 mg的各組大鼠肺組織標(biāo)本后用組織細(xì)胞快速放射免疫沉淀(RIPA)裂解液勻漿，在離心機(jī)(溫度為4℃、轉(zhuǎn)速12 000 r/min)下離心10 min，取上清液測(cè)樣本蛋白濃度。取25 μg蛋白上樣于制備好的凝膠中的每個(gè)孔上進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉處理后稀釋一抗(濃度1∶1 000)，環(huán)境溫度4℃下孵育過夜后次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(稀釋比例1∶10 000)中，37℃孵箱中孵育1 h后經(jīng)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑處理。暗室中曝光膠片，并做好標(biāo)記后掃描圖片存儲(chǔ)備用。AQP1和p-JNK表達(dá)量分別用AQP1陽性著色面積(IOD值)/內(nèi)參GAPDH陽性著色面積(IOD值)和p-JNK陽性著色面積(IOD值)/內(nèi)參GAPDH陽性著色面積(IOD值)來計(jì)算。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組BALF中細(xì)胞數(shù)及分類所占比 在6 h ALI組、6 h Control組、12 h ALI 組和12 h Control組BALF中白細(xì)胞數(shù)目及中性粒細(xì)胞所占比較NS組明顯增多，以12 h ALI組最多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；6 h Control組、12 h ALI組BALF中白細(xì)胞數(shù)目及中性粒細(xì)胞所占比明顯小于6 h ALI組(均P<0.01)，12 h Control組BALF中白細(xì)胞數(shù)目及中性粒細(xì)胞所占比明顯小于12 h ALI組(均P<0.01)。見表1。

表1 各組BALF中細(xì)胞數(shù)及分類所占比

2.2各組肺組織W/D值 在6 h ALI組(6.19±0.61)、12 h ALI組(7.52±0.42)、6 h Control組(5.58±0.29)和12 h Control組肺組織W/D值(6.03±0.16)較NS組(4.04±0.37)明顯增大(均P<0.01)，以12 h ALI組最大。6 h Control組肺組織中W/D值較6 h ALI組明顯減小(P<0.01)。12 h Control組W/D值較12 h ALI組明顯減小(P<0.01)。

2.3IHC法測(cè)定大鼠AQP1和p-JNK蛋白表達(dá)水平 AQP1主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，部分肺泡上皮及小氣道上皮細(xì)胞核和胞質(zhì)中有少量表達(dá)。6 h和12 h ALI、Control組肺組織中AQP1表達(dá)水平明均較NS組明顯減少(P<0.05)；6 h ALI組較6 h Control組、12 h ALI組較12 h Control組大鼠肺組織中AQP1蛋白表達(dá)量均明顯減少(均P<0.05)。見表2、圖1。

表2 IHC法測(cè)得各組大鼠肺組織AQP1、p-JNK蛋白表達(dá)水平

圖1 IHC法各組肺組織 AQP1的表達(dá)(×20)

p-JNK IHC結(jié)果顯示：其陽性細(xì)胞在小氣道上皮、肺泡上皮和血管內(nèi)皮的細(xì)胞核和胞質(zhì)中少量表達(dá)；與NS組比較，6 h ALI組、6 h Control組、12 h ALI 組和12 h Control組p-JNK表達(dá)顯著增多，其廣泛表達(dá)于氣道和肺泡的上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞當(dāng)中。6 h Control組和12 h Control組陽性細(xì)胞較NS組和CGRP組明顯增多(P<0.05)；6 h Control組和12 h Control組大鼠肺組織中p-JNK表達(dá)較相同時(shí)段的ALI組明顯增多(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 IHC 法各組肺組織p-JNK的表達(dá)(×20)

2.4Western印跡測(cè)各組大鼠肺組織AQP1和p-JNK表達(dá) 6 h ALI組、12 h ALI組、6 h Control組、12 h Control組AQP1表達(dá)明顯低于NS組(P<0.05)，p-JNK表達(dá)明顯高于NS組(P<0.05)；與6 h ALI組比較，6 h Control組AQP1表達(dá)量均明顯增加，p-JNK表達(dá)明顯減少(均P<0.05)；12 h Control組AQP1表達(dá)明顯高于12 h ALI組，p-JNK表達(dá)明顯低于12 h ALI組(均P<0.05)。見圖3、表3。

1～6：NS組、CGRP對(duì)照組、6 h ALI組、6 h Control組、12 h ALI組、12 h Control組圖3 Western印跡測(cè)各組大鼠肺組織AQP1和p-JNK的蛋白表達(dá)

表3 Western印跡測(cè)得各組大鼠肺組織AQP1、p-JNK的表達(dá)量

3 討 論

ALI/ARDS是由多種因素如重癥感染、休克和中毒等造成全身炎癥反應(yīng)綜合征，組織病理改變主要為肺泡上皮和血管內(nèi)皮受損致其通透性增加而導(dǎo)致肺泡和間質(zhì)的水腫，其主要表現(xiàn)為逐漸加重的呼吸困難和難以糾正的低氧血癥。肺部X線或肺部CT檢查主要表現(xiàn)為雙肺浸潤(rùn)性或滲出性改變〔7,8〕。ALI/ARDS是內(nèi)科的常見急危重癥，其起病急驟、進(jìn)展快，?？芍露嗯K器功能受損而導(dǎo)致死亡率高。

炎癥反應(yīng)機(jī)制為ALI/ARDS主要致病機(jī)制之一。炎癥反應(yīng)過度失控是其致病的核心環(huán)節(jié)，炎癥反應(yīng)失控進(jìn)一步加重肺泡上皮及血管內(nèi)皮的損傷，使血管內(nèi)皮通透性增加，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷，表面活性物質(zhì)生成減少，導(dǎo)致肺表面張力增大與順應(yīng)性降低，肺泡塌陷和有效通氣面積減少，因此出現(xiàn)呼吸窘迫、難以糾正的低氧血癥的表現(xiàn)。由于肺與全身血液及淋巴循環(huán)相通，肺是膿毒癥最早受累的臟器。研究表明，革蘭陰性桿菌感染〔9,10〕是最容易導(dǎo)致膿毒癥，而膿毒癥是導(dǎo)致ALI最常見因素之一〔11〕。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，在膿毒癥的致病機(jī)制中扮演著重要角色〔12〕。在構(gòu)建ALI的模型時(shí)，因干預(yù)藥物及干預(yù)方式的不同，ALI模型的嚴(yán)重程度亦有所不同。本實(shí)驗(yàn)在肺組織學(xué)改變中，病理改變以毛細(xì)血管充血、肺泡及間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，同時(shí)見肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞滲出及肺泡間隔增寬和紊亂，從另一角度說明本實(shí)驗(yàn)中，通過尾靜脈注射LPS建議大鼠的ALI模型亦是成功的。在本研究不足之處在于，BALF中中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)偏少，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道之間存在一定差異〔13〕，分析其原因可能為尾靜脈注射所致的ALI模型中血管內(nèi)皮損傷早，而肺泡和大氣道內(nèi)活化多形核白細(xì)胞遷移晚，而非直接氣管內(nèi)滴入導(dǎo)致的ALI模型中的多形細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯。

ALI/ARDS時(shí)主因肺泡液清除功能下降導(dǎo)致了肺水腫發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，AQP1分子量約29 kD，主要分布于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮，對(duì)肺組織水分的平衡和新生血管的生成等功能的調(diào)節(jié)以及維持機(jī)體正常的呼吸功能具有重要的意義〔14〕。AQP1數(shù)量多少或者功能的改變對(duì)肺泡內(nèi)液的形成和祛除具有重要的意義〔15〕。本研究結(jié)果提示過多肺泡內(nèi)液聚集于肺組織內(nèi)，AQP1參與了ALI時(shí)肺水腫的病理生理進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路是參與ALI時(shí)調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要通路之一，而AQPs的改變亦受到MAPK信號(hào)通路所調(diào)控。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路家族中JNK信號(hào)通路在ALI/ARDS的致病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果說明LPS可致使炎癥因子釋放增多，進(jìn)一步激活p-JNK，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)式放大效應(yīng)，進(jìn)一步推動(dòng)ALI發(fā)生與發(fā)展的病理進(jìn)程。

新發(fā)現(xiàn)的抗炎性介質(zhì)CGRP，其在ALI的致病過程中具有重要的抗炎的生物效應(yīng)。黃亮等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，CGRP干預(yù)可上調(diào)腦死亡大鼠中的肺組織AQP1表達(dá)水平，降低肺水含量而發(fā)揮減輕肺水腫的作用。CGRP除了具有擴(kuò)張血管、減輕肺水腫的作用以外，尚具有抗炎這一生物學(xué)效應(yīng)。本研究說明外源性CGRP可減輕ALI時(shí)肺內(nèi)的炎性反應(yīng)，提高AQP1的表達(dá)而達(dá)到減輕肺水腫的作用。同時(shí)間點(diǎn)的干預(yù)組大鼠肺組織p-JNK量比ALI組有減少，與陳龍等〔17,18〕的研究報(bào)道較為吻合，提示靜脈注射CGRP可抑制炎性介質(zhì)的釋放，致p-JNK失活，阻斷JNK信號(hào)通路以減輕ALI時(shí)肺臟的炎癥反應(yīng)和肺水腫程度而達(dá)到保護(hù)肺的作用。

綜上，炎癥反應(yīng)機(jī)制是ALI重要的致病機(jī)制，而MAPK信號(hào)通路參與與炎性反應(yīng)進(jìn)程。研究表明MAPK信號(hào)通路激活后，促進(jìn)了炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，加速了ALI發(fā)生和發(fā)展的病理進(jìn)程。CGRP作為新型炎癥消退介質(zhì)，其靜脈注射可抑制炎癥因子如TNF-α、IL-1β等的釋放，引起p-JNK活化受阻并且阻斷JNK信號(hào)通路的傳導(dǎo)，促進(jìn)ALI大鼠肺組織AQP1的表達(dá)，產(chǎn)生減輕ALI/ARDS時(shí)肺內(nèi)炎癥反應(yīng)和肺水腫的生物學(xué)功能。目前，對(duì)CGRP干預(yù)可以減輕ALI所致肺內(nèi)炎癥和肺水腫的機(jī)制研究中，AQP1的表達(dá)水平是直接提高或是通過JNK信號(hào)通路間接因素上調(diào)AQP1的表達(dá)尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究闡明。