張慧明 富堯 白淑菊 劉爽 呂冬云

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002;2生命科學(xué)學(xué)院)

前列腺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率與死亡率呈逐年上升的趨勢，早期診斷可以通過手術(shù)治療提高前列腺癌患者的治愈率〔1〕。然而，晚期前列腺癌患者的死亡率較高，同時患者存在癌細(xì)胞多器官轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象〔2〕?；瘜W(xué)療法在前列腺癌患者晚期治療階段起重要的作用，但是化學(xué)療法比較敏感，治療過程中機(jī)體會對化學(xué)藥物產(chǎn)生抗性，一旦復(fù)發(fā)化學(xué)療法由于抗化學(xué)性而變得無效〔3〕，需要尋找安全并且長久的靶向藥物來治療并減緩癌癥的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)證明，中藥對于惡性腫瘤有著很好療效〔4〕。地鱉蟲(ESW)是眾多常用作食物的昆蟲之一，是我國傳統(tǒng)的中藥，從古至今被用于治療許多不同的疾病，如瘀斑、創(chuàng)傷后傷口、肝纖維化和腫瘤。ESW有效成分中纖維蛋白物質(zhì)抗腫瘤作用有報道〔5〕，但其醇提物對前列腺癌的作用方式尚未明確，本實(shí)驗(yàn)研究ESW無水乙醇提取物(ESWE)抗腫瘤作用和潛在的信號傳導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 ESW粉末(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)：編號121533)，PC3細(xì)胞，DMEM高糖培養(yǎng)液，F(xiàn)-12培養(yǎng)液，胎牛血清(FBS)Gibco進(jìn)口分裝，青霉素，鏈霉素，吖啶橙溴乙錠(AO/EB)試劑盒(品牌solarbio)，實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒(生工生物公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，無水乙醇，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿等。細(xì)胞購于博士德公司。

1.2儀器 激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯FV1000)，倒置顯微鏡(萊卡)，酶標(biāo)儀(BioTek)，超聲機(jī)(KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲機(jī))，豎式電泳儀(北京六一)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞購自中國博士德生物科技有限公司，PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的F-12培養(yǎng)液中，均在37℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)。

1.4醇提物的制備 將ESW粉末在無水乙醇中浸泡6 h，超聲溫度50℃，超聲時間40 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提純，醇提物溶于二甲基亞砜(DMSO)4℃儲存，對照組加入相同劑量DMSO作為對照。

1.5ESWE對腫瘤細(xì)胞的抑制作用 將PC3細(xì)胞(1×104個)在96孔板中培養(yǎng)，醇提物濃度梯度為2、4、6、8、10、12 mg/ml。種板后24 h加藥同時設(shè)置對照組，每組3個復(fù)孔。藥物作用48 h。加入CCK8液100 μl/孔(CCK8∶培養(yǎng)液=1∶9)，1 h后酶標(biāo)儀波長450 nm下檢測吸光度值A(chǔ)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用公式計算細(xì)胞增殖抑制率。Graphpad軟件分析IC50值。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞PC3(1×105個)接種于6孔板，3個復(fù)孔。細(xì)胞生長完全融合后，用黃色的槍頭在孔板底部輕輕劃直線，PBS清洗2次繼續(xù)培養(yǎng)。取藥物濃度低劑量(2.0 mg/ml)、高劑量(4.0 mg/ml)為實(shí)驗(yàn)組，正常培養(yǎng)為對照組。藥物作用48 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞融合度并拍照。PC3細(xì)胞的運(yùn)動能力用劃痕愈合百分率來表示。

1.7遷移侵襲實(shí)驗(yàn) transwell小室做細(xì)胞遷移侵襲能力測定，將PC3細(xì)胞血清饑餓24 h，然后在含有醇提物的無血清培養(yǎng)基中鋪板(1×104細(xì)胞/孔)在24孔板的上室中濃度為2.0 mg/ml，4.0 mg/ml。下室填充1.5 ml含有10%FBS的培養(yǎng)基。作用48 h后，用棉簽刮下保留在膜上表面的細(xì)胞，甲醇∶冰乙酸(3∶1)固定30 min，吉姆薩染色15 min，清洗，晾干，倒置顯微鏡下拍照并計數(shù)。每組3個小室，每個小室選10個視野計數(shù)。

1.8AO/EB凋亡實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞(PC3)1×105個/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，爬片處理，分別取2.0 mg/ml，4.0 mg/ml為實(shí)驗(yàn)組，正常培養(yǎng)為對照組，每組分別鋪3個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到70%時，應(yīng)用AO/EB試劑盒觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，激光共聚焦顯微鏡觀察。AO/EB 測細(xì)胞凋亡，AO與核內(nèi)DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色熒光，可以透過完整的膜。EB與核內(nèi)DNA結(jié)合呈現(xiàn)橘紅色熒光，不能透過完整核膜。凋亡的細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光加強(qiáng)，形態(tài)皺縮成塊狀或圓珠狀。

1.9檢測細(xì)胞中Integrin(ITG)β1、ITG連接激酶(ILK)、纖維型肌動蛋白(F-actin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3 mRNA相對表達(dá)量 PC3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，90%融合度時加入不同劑量組藥物作用。48 h后加入TRIzol裂解細(xì)胞收集裂解液，提取總RNA，PCR反轉(zhuǎn)錄，qPCR均使用生工試劑盒構(gòu)建，按說明書完成，所用引物為GAPDH正義鏈：5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反義鏈：5′AGGGG CCATCCACAGTCTTC-3′。ITGβ1正義鏈：5′-ACCTG CCTTGGTGTCTGTG-3′，反義鏈：5′-CAACTTCTCCC TGCTTTCCA-3′。ILK正義鏈：5′-GACGAAGCTCA ACGAGAA-3′，反義鏈：5′-AGTCCCTGCTCTTCCTTGT-3′。F-actin正義鏈：5′-CTCCATCCTGGCCTC GCTGT-3′，反義鏈：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。Caspase3正義鏈：5′-ACTGGAAAGCCGAAACTC TTCATCA-3′，反義鏈：5′-GGAAGTCGGCCTCCACTGGTATC-3′。

1.10免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn) 蛋白制備：取對數(shù)生長期細(xì)胞(PC3)1×105個/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度接近90%時，加藥。分別取2.0、4.0 mg/ml為實(shí)驗(yàn)組，正常培養(yǎng)為對照組，每組分別鋪3個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)，48 h后提蛋白。沸水使其變性，-80℃保存。WB：蛋白樣品上樣-電泳-轉(zhuǎn)膜-5%的血清白蛋白(BSA)封閉-封一抗(ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3)分別1∶1 000配比，4℃搖動過夜。次日，洗膜-封入抗兔、抗鼠二抗，1∶4 000配比，洗膜。條帶顯色3 min，曝光時間根據(jù)蛋白的不同而有差異(5 s至5 min)。

1.11數(shù)據(jù)分析 采用Graphpad8.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ESWE對腫瘤細(xì)胞的抑制作用 不同濃度的ESWE對PC3細(xì)胞具有比較明顯的抑制作用，2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/ml的抑制率分別為(7.58±2.60)%、(20.92±5.40)%、(42.55±12.60)%、(68.47±4.80)%、(86.47±1.79)%、(90.15±1.11)%。其中對PC3的IC50值為6.265 mg/ml。

2.2ESWE對PC3細(xì)胞遷移能力的影響 與0 h對比，作用48 h后對照組遷移率為93.6%±2.3%，2.0、4.0 mg/ml組遷移率分別為70.2%±2.0%、60.6%±1.8%，見圖1，隨著藥物濃度的增加遷移率逐漸降低。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測作用不同時間PC3細(xì)胞遷移能力(×50)

2.3ESWE對PC3細(xì)胞侵襲能力的影響 用生長48 h的PC3細(xì)胞通過transwell小室的數(shù)目來計算細(xì)胞的侵襲能力，對照組侵襲數(shù)為(107.6±2.0)個，2.0、4.0 mg/ml組分別為(70.8±1.6)個、(42.8±1.5)個，隨藥物濃度的升高侵襲能力逐漸減弱(P<0.01)。見圖2。

圖2 transwell實(shí)驗(yàn)檢測PC3細(xì)胞株侵襲能力(吉姆薩染色，×100)

2.4ESWE對PC3細(xì)胞凋亡的影響 對照組細(xì)胞核呈規(guī)則形態(tài)，未見凋亡現(xiàn)象。2.0 mg/ml組細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的皺縮現(xiàn)象，呈早期凋亡的現(xiàn)象。4.0 mg/ml組多個細(xì)胞核呈現(xiàn)皺縮、塊狀，呈晚期凋亡現(xiàn)象，見圖3。藥物可促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴。

2.5ESWE對PC3細(xì)胞 ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3 mRNA表達(dá)的影響 隨著ESWE濃度的增加ITGβ1 mRNA表達(dá)量4.0mg/ml組顯著低于2.0 mg/ml組，2.0、4.0 mg/ml組顯著低于對照組(P<0.05)；ILK mRNA表達(dá)量2.0、4.0 mg/ml組低于對照組且具有顯著性差異(P<0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組無顯著差異性(P>0.05)；F-actin mRNA表達(dá)量沒有明顯變化；而Caspase3 mRNA表達(dá)量2.0、4.0 mg/ml組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組不具有顯著差異性(P>0.05)。見表1。

箭頭所示為細(xì)胞凋亡圖3 PC3細(xì)胞凋亡(AO/EB染色，×600)

表1 ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3mRNA相對表達(dá)量比較

2.6ESWE對PC3細(xì)胞ITGβ1、ILK、F-actin、Capase3蛋白表達(dá)的影響 隨ESWE濃度升高ITGβ1、ILK、F-actin表達(dá)量均下降，ITGβ1 2.0 mg/ml組與對照組差異不顯著(P>0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組、對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；ILK 2.0 mg/ml組與對照組、4.0 mg/ml組比較具有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)-actin 2.0 mg/ml組與對照組比較差異不顯著(P>0.05)，2.0 mg/ml組與4.0 mg/ml組比較有顯著性差異(P<0.05)；Caspase3表達(dá)量隨ESWE濃度升高逐漸上升，2.0 mg/ml組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組比較有顯著性差異(P<0.05)。見圖4，表2。

圖4 WB檢測各組ITGβ1/ILK/F-actin及Caspase3蛋白水平

表2 各組ITGβ1/ILK/F-actin及Caspase3灰度值

3 討 論

ESW為中國著名的食用和藥用昆蟲，用作傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)骨損傷、血瘀和免疫相關(guān)疾病的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明ESWE可以抑制各種腫瘤的生長〔6〕。本實(shí)驗(yàn)從ESW粉末中通過化學(xué)提純的方法提取醇提物〔7〕體外作用前列腺癌細(xì)胞PC3。本實(shí)驗(yàn)得出ESWE可以降低ITGβ1、ILK并上調(diào)Caspase3蛋白質(zhì)表達(dá)，ESWE的抗侵襲作用是前列腺癌細(xì)胞通過ITGβ1降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分調(diào)節(jié)ILK與F-actin表達(dá)，上調(diào)Caspase3表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，這與ECM層黏連蛋白與腫瘤表面受體相互結(jié)合從而降解ECM，構(gòu)成局部溶解通道，從而降低細(xì)胞黏附性有直接聯(lián)系〔8〕。 ITGβ1介導(dǎo)細(xì)胞與ECM層黏連蛋白的黏附能力〔9〕，ITGβ1表達(dá)量高則細(xì)胞黏附性弱，反之則強(qiáng)。ITG家族本身不具有激酶的活性，與ECM結(jié)合后激活I(lǐng)LK招募Paxillin、Parvin、Plectin等與actin相結(jié)合從而啟動ITG信號通路，調(diào)節(jié)骨架蛋白F-actin的組裝〔10〕。ILK靶向催化絲/蘇氨酸蛋白激酶(PKB/Akt)，PKB磷酸化下游蛋白底物糖原合成酶激酶(GSK)-3β調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔11〕。PKB/GSK3β活化后可以減少因線粒體膜通透性改變所引起的細(xì)胞凋亡,并顯著降低Caspase3的表達(dá)及活性〔12〕。

在一些研究中已經(jīng)報道了ESW可溶性蛋白的抗腫瘤活性〔5〕，醇提物與腫瘤的抑制作用相關(guān)研究很少，其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。本研究證明ESWE通過 ITGβ1/ILK/F-actin信號途徑參與前列腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲過程，在此過程中影響了微絲骨架蛋白F-actin重構(gòu)，但并不影響其總量的表達(dá)。同時ILK可調(diào)節(jié)下游蛋白Caspase3促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果可為新的腫瘤治療藥物的研究提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝:黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢特色學(xué)科建設(shè)項目提供資助！