孫玉珍 李世朋 趙建龍

(1阜外華中心血管病醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2焦作市人民醫(yī)院普外科；3河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

miRNA家族是長(zhǎng)度約22個(gè)堿基的小分子非編碼單鏈RNA，具有廣泛性和多樣性的特點(diǎn)，能夠阻遏mRNA的翻譯，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。人們發(fā)現(xiàn)miRNA具有重要的監(jiān)管職能并能調(diào)控多種生物進(jìn)程，其表達(dá)的改變能夠?qū)е掳┌Y的發(fā)生及進(jìn)展〔1〕。其中miRNA-192在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中所起的作用受到人們的廣泛關(guān)注，但miRNA-192在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及臨床意義還需進(jìn)一步研究。本研究探討miRNA-192在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年6月至2013年 8月接受肝細(xì)胞癌手術(shù)治療的肝細(xì)胞癌組織43例及癌旁組織33例，組織學(xué)分級(jí)按Edmondson-Steiner分級(jí)法分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，Ⅰ～Ⅱ級(jí)歸為高中分化組，共31例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)歸為低未分化組，共12例。TNM分期按照UICC/AICC 2010年標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期18例。有淋巴轉(zhuǎn)移6例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移37例。所有患者術(shù)前未行放化療，臨床資料完整。另取正常肝臟組織25例作為對(duì)照。病理診斷由兩位病理科醫(yī)生采用雙盲法認(rèn)定。

1.2主要試劑與儀器 mirVanaTM miRNA提取和分離試劑盒(Ambion，美國(guó))，Taq DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶(Fermentas，深圳)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega 美國(guó))，RiboLock RNA 酶抑制劑(Fermentas，深圳)；DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀(北京市六一儀器廠)，PTC-200型PCR熱循環(huán)儀(Bio-Rad，美國(guó))，iQ5熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))，LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)(UVP，美國(guó))，F(xiàn)-4500型突光檢測(cè)儀(HITACHI，日本)，UV-2000型可見(jiàn)/紫外分光光度計(jì)(UNICO，美國(guó))。地高辛標(biāo)記的miRNA-192探針(稀釋至100 nmol/L)，原位雜交試劑盒(博士德，武漢)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液試劑盒(中杉金橋，北京)，其余試劑為分析純。

1.3原位雜交 原位雜交檢測(cè) microRNA-192，將組織切片脫蠟和水化，蛋白酶 K(1 μg/ml)室溫孵育30 min。滴加0.1 mol/L甘氨酸-磷酸鹽緩沖液(PBS)終止消化，滴加預(yù)雜交液，預(yù)雜交30 min。0.2×SSC緩沖液沖洗后滴加雜交液，90℃孵育10 min，將切片置于盛有0.2×SSC緩沖液的濕盒中37℃孵育過(guò)夜 。沖洗后滴加封閉液，37℃孵育30 min。滴加兔抗地高辛IgG，濕盒37℃孵育30 min。PBS沖洗，滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG，濕盒37°孵育30 min。滴加DAB顯色。雜交過(guò)程以U6探針(1 nmol/L)作為陽(yáng)性對(duì)照，去除探針作為陰性對(duì)照。microRNA-192以腫瘤細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。采用半定量積分法判斷結(jié)果。染色強(qiáng)度分級(jí)：1分，無(wú)染色，為陰性；2分，低等強(qiáng)度染色，為弱陽(yáng)性；3分，中等強(qiáng)度染色，為中等陽(yáng)性，>3分，強(qiáng)染色，為強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：1分為陽(yáng)性表達(dá)率<10%；2分為陽(yáng)性表達(dá)率 10%～50%；3分為陽(yáng)性表達(dá)率>50%。以上兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘，得分1～3分者為低表達(dá)，>3分為高表達(dá)。

1.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR 將組織脫蠟及水化，蛋白酶K消化后，按mirVanaTM miRNA提取和分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總miRNA 。根據(jù)miRNA-192的基因信息及內(nèi)參U6的基因信息，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)RT及PCR引物，miRNA-192 RT引物序列：5′-GAGGCACAGCUUGACCUAUG AAUUGCAGCCAGGCUCCGUGUUGAACUGGAUACUU AACGUCGGUC GGCTGT-3′；PCR引物序列：正義鏈5′-CTGACCTATGAATTG-3′，反義鏈5′-GACCTATGAATT-3′。U6 RT引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；PCR引物序列正義鏈5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反義鏈5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。按照 Taqman microRNA assay 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 試劑盒的方法，首先對(duì)各組織的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量 PCR，條件：50℃，10 s；95℃，9 min；95℃，12 s；循環(huán)35次，60℃，1 min，50 μl反應(yīng)體系。iQ5熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)讀出各組織的 Ct 值，miRNA-192相對(duì)表達(dá)量的 microRNA分析用 U6 作內(nèi)參，結(jié)果用 ABI自帶軟件分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1原位雜交的結(jié)果分析 miRNA-192探針結(jié)果顯示呈棕黃色顆粒的陽(yáng)性信號(hào)，定位于胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。miRNA-192在正常肝組織、癌旁和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.698，P<0.000 1)，見(jiàn)表1。

圖1 miRNA-192在不同組織中的表達(dá)(DAB，×200)

表1 miRNA-192在不同組織中的表達(dá)(n)

2.2RT-PCR的結(jié)果分析 在肝細(xì)胞癌組織中 miRNA-192的含量(1.83±0.43)顯著低于正常肝臟組織(4.05±0.32，P<0.01)及癌旁組織(2.89±0.19，P<0.05),且癌旁組織miRNA-192的含量明顯低于肝細(xì)胞癌組織(P<0.05)。

2.3miRNA-192的表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miRNA-192在低未分化肝細(xì)胞癌中的陽(yáng)性率明顯低于高中分化者(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織中miRNA-192的表達(dá)水平低于比Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌中的陽(yáng)性率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 肝細(xì)胞癌中miRNA-192表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

肝細(xì)胞癌占全世界原發(fā)性肝癌的70%～85%〔2〕，在我國(guó)約占90%〔3〕。研究證明，肝細(xì)胞癌發(fā)生過(guò)程中有的microRNA含量上升，有的microRNA含量下降，異常表達(dá)的microRNA影響其發(fā)生侵襲性和預(yù)后〔4，5〕，它們能通過(guò)特異性結(jié)合于蛋白mRNA的3端非編碼區(qū)(3′-UTR)，從而影響該蛋白的表達(dá)。miRNA-192(MI0000234)定位在11號(hào)染色體(64658609-64658718)，在肝臟、結(jié)腸和腎臟組織中表達(dá)豐富〔6〕。miRNA-192目前已被證實(shí)在多種腫瘤中均存在表達(dá)異常的現(xiàn)象，提示其參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的生物功能。吳蔚蕓等〔7〕采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中miRNA-192的表達(dá)下調(diào)，顯著低于非腫瘤組織，并發(fā)現(xiàn)miRNA-192的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)；Feng等〔8〕的研究表明與正常肺組織相比，miRNA-192在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，在體外實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miRNA-192通過(guò)作用于RB1基因可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡。李娟〔9〕發(fā)現(xiàn)在胃癌miRNA-192低表達(dá)組中，miRNA-192的低表達(dá)與腫瘤的大小、大體分型和pT分級(jí)相關(guān)。腫瘤越大，分型分級(jí)越重，miRNA-192表達(dá)量越低。謝瓊慧等〔10〕初步證實(shí)HepG2細(xì)胞中miRNA-192的下調(diào)能夠降低p53和CD-KNIA的表達(dá)水平，抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。下調(diào)RB1表達(dá)很可能是miRNA-192促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一〔11〕。於雷〔12〕利用microRNA芯片發(fā)現(xiàn)miRNA-192在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，體現(xiàn)出抑癌作用，腫瘤組織中miRNA-192與患者術(shù)后無(wú)瘤生存率顯著相關(guān)。本結(jié)果說(shuō)明miRNA-192表達(dá)水平的下降與肝細(xì)胞癌的組織類(lèi)型、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移情況存在相關(guān)性。這些特征都與腫瘤的發(fā)展及不良生物學(xué)行為密切相關(guān)，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更是患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志，因此我們推測(cè)miR-192表達(dá)下調(diào)在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，并影響肝細(xì)胞癌患者的遠(yuǎn)期生存預(yù)后。microRNA-192 有望作為一種預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌病情進(jìn)展及預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。