亓衛(wèi)東 丁大連 曹軼倓 袁芳

1復旦大學附屬華山醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海200040 2美國紐約州立大學布法羅分校耳聾及聽力研究中心 NY 14214 USA

RNA干擾（RNAi）作為一種轉錄后階段的基因沉默工具，可起到高度特異性的基因敲除效果，與傳統(tǒng)的基因敲除及反義技術相比具有高效、特異、低毒、周期短、操作簡單等優(yōu)勢。RNAi在內(nèi)耳的應用取決于能否保證siRNA高效轉染以及載體的低毒性。我們構建了一種小干擾RNA（siRNA）蛋白轉導載體細胞穿透肽-雙鏈RNA結合域重組融合蛋白（TAT-DRBD）。通過活體動物實驗已經(jīng)證實，這種載體可在24小時內(nèi)成功攜帶Cy3標記的siRNA進入耳蝸內(nèi)毛細胞和外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、血管紋上皮細胞、橢圓囊斑和球囊斑及壺腹嵴的毛細胞和支持細胞，其經(jīng)圓窗膜徑路的轉染效率達到100%[1]。在本研究中，我們在內(nèi)耳器官離體條件下進一步驗證TAT-DRBD載體的轉染效率及安全性，并與經(jīng)典脂質體載體LipoFiterTM的安全性進行了比較。我們建立了卡鉑南美栗鼠的內(nèi)耳損害動物模型，并在活體南美栗鼠應用RNAi特異性下調Slc31a1基因的表達，以進一步證明通過對銅轉運輸入通道的暫時特異性阻斷是否可以有效阻止鉑制劑進入靶細胞，從而實現(xiàn)對毛細胞的保護。

圖1 DNA重組TAT-DRBD載體標準化構建流程Fig.1 Standardized process to construct TAT-DRBD vector by DNA recombination technology

1 材料和方法

1.1 TAT-DRBD載體的構建

細胞穿透肽-雙鏈RNA結合域重組融合蛋白（TAT-DRBD）由上海近岸蛋白質生物有限公司完成構建。標準化構建流程及氨基酸序列見圖1，圖2。質控標準，蛋白純度：SDS-PAGE＞95%，經(jīng)檢測內(nèi)毒素＜1EU/mg，宿主DNA殘留＜10ng/劑量，宿主蛋白質殘留＜0.1%。細胞株于液氮中長期保存?？筛鶕?jù)需要隨時復蘇增殖表達。

1.2 大鼠耳蝸器官型培養(yǎng)，TAT-DRBD體外轉染效率及與脂質體LipoFiterTM安全性比較

圖2 TAT-DRBD氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of TAT-DRBD

新生SD大鼠（P3～5天，購自上海斯萊克）8只（16耳），雌雄不限。動物斷頭處死，分離取出耳蝸，在Hank’s液（Sigma H6648）中以游絲鑷仔細去除耳蝸外側骨壁及螺旋韌帶，小心將全耳蝸基底膜自蝸軸取下并分離內(nèi)側的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。事先將含鼠尾膠（Corning 354236）、10×Basal Medium Eagle(10×BME,Sigma B9638)和2%碳酸鈉（Sigma 451614），以9:1:1比例混合。在35mm培養(yǎng)皿中滴入15μl上述預先配制好的溶液并在室溫下靜置20分鐘使之凝結成膠。培養(yǎng)皿內(nèi)滴入1.5ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)液由2g血清蛋白粉(BSA,Sigma A-4919),2ml Serum-Free Supplement(Sigma I-1884),4.8ml 20%glucose(Sigma G-2020),2 ml 200 mM glutamine(Sigma G-6392),191.2 ml of 1×BME(Sigma B-1522)預混而成。將Hank’s液內(nèi)的基底膜取出平鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)的凝膠上，放入培養(yǎng)箱(Forma Scientific,USA)，于37℃/5%CO2條件下過夜。

次日培養(yǎng)皿更換培養(yǎng)液，取4個培養(yǎng)皿內(nèi)加入Cy3標記的siRNA（廣州銳博）/TAT-DRBD預混液使之終濃度達到100nM/400nM繼續(xù)培養(yǎng)12小時。10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定0.5小時，0.1M PBS輕輕洗滌3次。以Alexa 488 phalloidin(Thermo Fisher A12379;1:200 in PBS)染色30分鐘，Topro-3（Thermo Fisher,T3605,1:1000 in PBS）染細胞核30分鐘，滴甘油蓋片。激光共聚焦顯微鏡下觀 察（Zeiss 710，excitation/emission：Alex488:495nm/518nm,Cy3:570nm/650nm,To-Pro-3:642nm/661nm）。

12個培養(yǎng)皿隨機分為2組（6耳/組），一組加入TAT-DRBD使之濃度至400nM,另外一組按照操作手冊每皿加入LipoFiterTM3μl。48小時后10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定0.5小時，0.1M PBS輕輕洗滌3次。以Alexa 488 phalloidin(Thermo Fisher A12379;1:200 in PBS)染色30分鐘，滴甘油蓋片。激光共聚焦顯微鏡下觀察（Zeiss 710，excitation/emission：Alex488:495nm/518nm）。圖像處理使用配套軟件ZEN2.3和Photoshop CS6。

1.3 建立卡鉑內(nèi)耳損害動物模型及CAP檢測

選擇健康成年（9-12月）南美栗鼠（牡丹江楓丹毛絲鼠養(yǎng)殖有限公司，雌雄不限）8只，體重400g～600g。動物入組前均通過耳廓反射檢查和耳鏡檢查，采用自身對照，所有動物右耳為對照耳，左耳為靶向Slc31a1基因siRNA轉染耳。動物均在轉染24小時后接受單次腹腔內(nèi)卡鉑（Sigma C2538，50mg/kg）注射，卡鉑于臨用前溶于5%葡萄糖。所有動物在轉染前及在卡鉑腹腔注射12天后實驗終點處死前檢測復合聽神經(jīng)動作電位（compound action potential，CAP）。

1.4 南美栗鼠Slc31a1基因靶向siRNA序列、轉染液配制及轉染操作

根據(jù)南美栗鼠Slc31a1的mRNA序列設計構建了2條靶向siRNA(廣州銳博)，靶序列分別為：GCATGACGATGATGCCTAT和 GCTACTTTCTCATGCTAAT。轉染液于使用臨時配制。將80 μl 10μM 混合 siRNA（各50%）加入 320 μl of 5.5-6 μM TAT-DRBD混合，室溫下放置30 min。對照組轉染液將80μl 10μM NC-control siRNA加入320μl PBS。動物麻醉后打開聽泡，暴露圓窗龕，使用顯微注射器將大約 20μl（siRNA 2μM/TAT-DRBD 5μM）的轉染液滴入圓窗龕，靜置5分鐘。使用牙托粉封閉骨窗，絲線縫合傷口。動物保持水平位30分鐘。動物均在注射12天后實驗終點處死并全耳蝸鋪片計數(shù)毛細胞，通過耳蝸圖軟件繪制平均耳蝸圖。

1.5 耳蝸毛細胞的標記和全耳蝸基底膜取材鋪片及毛細胞數(shù)據(jù)采集

麻醉狀態(tài)下取出聽泡，充分暴露鼓室內(nèi)壁。解剖顯微鏡下以0.6mm金鋼鉆在蝸尖磨一個小孔作為耳蝸灌流的進入孔，以顯微鉤針輕輕將鐙骨推入前庭池使前庭窗開放，標本采用琥珀酸脫氫酶（Succinic dehydrogenase,SDH）對毛細胞進行永久性特殊標記[2]。將顳骨浸入預混好的SDH孵育液并經(jīng)蝸尖小孔向耳蝸內(nèi)緩慢灌流2-3次直至灌流液從圓窗和卵圓窗流出，然后在38℃恒溫箱內(nèi)孵育45min直至肉眼可透過骨殼見耳蝸各回呈明顯藍色為止。將顳骨浸入10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液并灌流固定液2-3次。將顳骨浸入固定液在4oC冰箱內(nèi)繼續(xù)固定至少24小時。解剖顯微鏡解剖全耳蝸膜迷路，分段取下全耳蝸基底膜，將取下的基底膜鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋片并用中性樹膠封片。

耳蝸樣品于高分辨率顯微鏡（Olympus IX73）下觀察，二組樣品選取鋪片完整、毛細胞機械損傷少且毛細胞染色清楚的基底膜進行內(nèi)外毛細胞計數(shù)。攝片自基底膜頂回開始，調整焦距續(xù)貫獲得基底膜上所有毛細胞的清晰照片，加入100μm標尺。應用耳蝸圖軟件（Cochleogram Plotter）計算出基底膜全長各個不同位點毛細胞損失程度的單個耳蝸圖和平均耳蝸圖。

2 結果

2.1 TAT-DRBD在體外的轉染效率與脂質體載體LipoFiterTM在離體條件下的安全性比較

通過新生大鼠耳蝸器官型培養(yǎng)體系證實，轉染12小時后TAT-DRBD能夠在離體條件下有效地轉染siRNA進入基底膜內(nèi)、外毛細胞，轉染效率達到100%，且無明顯耳毒性（圖3）。圖4顯示了在離體條件下，新生大鼠耳蝸基底膜中段在加入指質體LipoFiterTM48小時后會導致嚴重的耳基底膜內(nèi)、外毛細胞損害且纖毛排列紊亂。

圖3 體外培養(yǎng)大鼠耳蝸基底膜經(jīng)TAT-DRBD為載體轉染Cy3標記siRNA(紅色熒光)12小時后激光共聚焦圖像（×400）。樣品經(jīng)Alexa Fluor 488 Phalloidin(綠色熒光，顯示毛細胞的靜纖毛和表皮板)、To-Pro-3(藍色熒光，顯示細胞核)染色.該3維圖像顯示，轉染12小時后，Cy3標記siRNA已充滿內(nèi)、外毛細胞的細胞質。Fig.3 The confocal laser image(×400)of rat cochlear basilar membrane cultured in vitro after transfected with Cy3 labeled siRNA(red fluorescence)carried by TAT-DRBD for 12 hours.The sample was stained with Alexa Fluor 488 Phalloidin(green fluorescence,showing the stereocilium and cuticular plate of hair cells),To-Pro-3(blue fluorescence,showing the nucleus).This 3D image showed Cy3 labeling siRNA has filled the cytoplasm of inner and outer hair cells after 12 hours.

圖4 A、B、C分別顯示離體耳蝸器官培養(yǎng)對照，以及分別加入TAT-DRBD，脂質體LipoFiterTM48小時后激光共聚焦照片（×400），LipoFiterTM導致較嚴重的內(nèi)、外毛細胞損害。Fig.4 Figures A,B and C show culture of cochlea in vitro for 48 hours as control,treated with TAT-DRBD and LipoFiterTM,respectively.The cochlea treated with LipoFiterTM shows more advanced damage of inner and outer hair cells.

2.2 RNAi介導的Slc31a1基因表達下調對卡鉑南美栗鼠內(nèi)耳損害的保護

南美栗鼠經(jīng)單次腹腔注射卡鉑（50mg/kg）12天后全耳蝸鋪片平均耳蝸圖顯示，經(jīng)RNAi介導的Slc31a1基因下調對卡鉑內(nèi)耳損害有一定的保護作用（圖5）。治療耳（左耳）組內(nèi)毛細胞僅在距蝸尖（Apex）45%～85%距離處有不超過20%的毛細胞丟失，曲線平緩。而對照組（右耳）全程均有IHC損害，在距蝸尖65%～75%處有近40%的IHC丟失。所有動物左、右耳在卡鉑注射前后Click短純音誘發(fā)的CAP閾值沒有發(fā)生改變。

圖5 南美栗鼠經(jīng)圓窗膜轉染siRNA沉默Slc31a1(Ctr1)基因對卡鉑耳毒性的保護作用。圖A和B為轉染耳（左耳，N=8）全耳蝸鋪片耳蝸圖和底回毛細胞（SDH染色，×100），顯示底回IHC僅在距頂回65%處有近20%的丟失，而對照組（右耳，N=8）在距頂回50%～100%處的IHC損失程度均較治療組高（圖C和D）。Fig.5 Against carboplatin ototoxicity of chinchilla by transfection with siRNA through round window membrane to suppress Slc31a1(Ctr1)expression.Figures A and B showed the surface preparations of the transfected ear(left,N=8)and basal turn hair cells(SDH staining,×100),indicated IHCs lost nearly 20%at 65%from the apex,while the control group(right ear,N=8)had a higher degree of IHCs loss at 50%～100%from the apex than the treatment group(Figures C and D)

3 討論

RNAi是小RNA分子靶向特異性結合mRNA并使其降解以抑制特定基因表達的過程。由于RNAi技術投入少、周期短、操作簡單，幾乎成為一種標準化的分子生物學技術，被廣泛應用于基因治療和基因功能研究等領域。RNAi能夠高效、特異地下調靶基因的表達水平，若能用于臨床，將是一種十分有前景的疾病治療方法[3,4]。由于內(nèi)耳解剖生理的特殊性，RNAi在內(nèi)耳能否發(fā)揮效應取決于轉染載體的高效性和安全性。就非病毒載體而言，脂質體載體因具有高沉默效率而被廣泛應用。但有研究發(fā)現(xiàn)脂質體經(jīng)圓窗膜滲透率低而且作用短暫[5]，這限制了RNAi技術在內(nèi)耳的應用。

TAT-DRBD作為一種新型的基因重組蛋白載體，具有無毒、高效、可降解的特點，我們在活體南美栗鼠證實其可高效轉染內(nèi)耳多個靶細胞且無明顯毒性[1]。在本研究中，應用大鼠耳蝸器官培養(yǎng)，同樣證明該載體在離體條件下無明顯耳毒性作用。在安全性方面較脂質體有明顯優(yōu)勢。我們在進一步的實驗中發(fā)現(xiàn)（資料未列），在BRL細胞系，TAT－DRBD介導的RNAi沉默Slc31a1基因效率可達70%，但較LipoFiterTM略低（＞90%）。

耳神經(jīng)毒性是抗腫瘤鉑制劑的主要毒副作用之一。抗腫瘤鉑制劑發(fā)揮其細胞毒性作用的前提是藥物必須首先要進入到細胞內(nèi)部，只有當鉑制劑與細胞內(nèi)的氯離子發(fā)生水合作用再與谷胱甘肽相結合，才能實現(xiàn)其對靶細胞的攻擊性。目前已經(jīng)確定鉑制劑進出細胞的唯一途徑是通過細胞膜上的銅轉運通道，實驗證實阻斷銅通道可以有效阻止鉑制劑進入到細胞內(nèi)，從而獲得理想的保護效果[6,7]。除了通過提高細胞外銅離子濃度激發(fā)機體對銅轉運通道輸入蛋白的反饋性抑制或應用銅通道抑制劑保護內(nèi)耳細胞之外[6-9]，應用RNAi技術使銅轉運內(nèi)流蛋白通道暫時性“沉默”，從而阻斷鉑制劑進入到靶細胞，是保護內(nèi)耳毛細胞免受抗腫瘤鉑制劑損害的一個“拒敵于國門之外”的新策略。

卡鉑是一種具有耳毒性和神經(jīng)毒性的抗腫瘤鉑制劑。研究證實，鉑（Pt）進出細胞的跨膜轉運是通過銅轉運通道[6-8,10]，其中銅轉運蛋白Ctr1（Copper transporter Ctr1，由Slc31a1基因編碼)是將細胞外的銅和鉑轉入到細胞內(nèi)的內(nèi)流轉運蛋白（Influx transporter），而銅轉運蛋白ATP 7A和7B（ATP7A、ATP7B）是將細胞內(nèi)的銅和鉑排出到細胞外的外排轉運蛋白（Efflux transporters），此外，陽離子轉運蛋白 2(Organic cation transporter 2，OCT2)等也與鉑制劑耳毒性發(fā)生關系密切[10,11]。我們在此前的研究證實[7]，在大鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元及血管紋上皮細胞內(nèi)均富含Ctr1、ATP7A和ATP7B[7]。More也發(fā)現(xiàn)Ctr1在小鼠耳蝸廣泛存在，并與順鉑的耳毒性關系密切[11]。Larson通過活體實驗證實，小鼠敲除Ctr1基因后順鉑幾乎完全喪失了對腫瘤細胞的損害作用[12]。這些結果說明只要阻斷了Ctr1的活動就可以有效阻止鉑制劑進入靶細胞，從而使靶細胞得到最好的保護?；谶@個保護機制，我們研制出可使Ctr1基因暫時性“沉默”的siRNA，這種siRNA經(jīng)蛋白轉導載體TAT-DRBD轉染進入細胞，以達到阻斷Ctr1內(nèi)流蛋白通道的保護目的。

南美栗鼠是目前唯一被發(fā)現(xiàn)的可被藥物（卡鉑）選擇性破壞耳蝸IHC、前庭I型毛細胞及與之相連的耳蝸和前庭周邊神經(jīng)元的哺乳類動物[13]。這種獨特的損害周邊I型傳入神經(jīng)系統(tǒng)模式使之在某種程度上可被用于模擬聽神經(jīng)病[14,15]，因而特別有利于研究IHC-傳入神經(jīng)通路的生理病理損害過程。在本研究中，我們采用小劑量（50mg/kg）單次卡鉑腹腔注射，平均耳蝸圖顯示在距蝸尖65%～75%處有近40%的IHC丟失。我們此前的研究證實，損失40%IHC的南美栗鼠并不發(fā)生CAP的閾移[2]。我們早先的研究也證明，即使IHC損失60%以上，聽神經(jīng)單纖維仍可保持正常的閾值和陡峭的特征頻率調諧曲線[16,17]。

由于轉運機制相同，銅轉運蛋白在上述鉑制劑毒副作用發(fā)生中扮演著關鍵角色，這為我們防范鉑制劑毒副作用指明了一個可行的研究方向。Ctr1由Slc31a1基因表達，應用特定的基因治療工具抑制其表達理論上可阻斷鉑進入細胞并進而預防耳毒性發(fā)生。在本研究中，通過TAT-DRBD轉染靶向Slc31a1和siRNA進入南美栗鼠內(nèi)耳，以干擾卡鉑的跨膜轉運，從平均全耳蝸圖結果看，起到了較明顯的保護作用。Ctr1是鉑跨膜轉運的主要內(nèi)流蛋白，但是細胞膜鉑的轉運機制復雜，還涉及流出通道如ATP7A及ATP7B的影響，單一“關閉”某一蛋白可能難以達到“完全”的阻斷。但盡管如此，以上結果仍提示應用RNAi特異性抑制鉑跨膜轉運蛋白表達以保護卡鉑耳毒性具有潛在的研究價值和應用前景。