劉夢婷 孟琦 葉祎菁 段昌宇 林士堯 張?zhí)旌?/p>

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(哈爾濱 150001)

鰓耳腎譜系（Branchio-oto-renal Syndrome，BOR）由Melnick等在1975年首次報道，是常染色體顯性遺傳性疾病，屬于綜合征性耳聾[1]。它的主要臨床表現(xiàn)為鰓裂發(fā)育異常、耳前瘺管、聽力損失以及腎臟疾病。而鰓耳綜合征是鰓耳腎綜合征譜系的一種，除缺乏腎臟表現(xiàn)外其它與鰓耳腎綜合征相同[2]。該病在新生兒中發(fā)病率為1/40000，在重度及極重度聾兒中的發(fā)病率為2%[3]。

臨床診斷和分子診斷相結合是綜合征性耳聾診斷的要點。Chang[4]等2004年提出的鰓耳腎綜合征譜系臨床診斷標準，至今仍被廣泛應用。提出主要臨床表現(xiàn)為：①鰓裂瘺管或囊腫；②耳聾；③耳前瘺管；④腎臟畸形。次要臨床表現(xiàn)為：①外耳異常；②中耳畸形；③內(nèi)耳異常；④其他:面部不對稱或味覺異常等?；颊吲R床表現(xiàn)必須滿足以下三個條件之一方可診斷為鰓耳腎綜合征譜系：①至少3項主要表現(xiàn)；②具有2項主要表現(xiàn)，并同時有至少2項次要表現(xiàn)；③具備1項主要表現(xiàn)，且有至少1個一級親屬中有鰓耳腎綜合征譜系患者。

現(xiàn)已知引起鰓耳腎綜合征譜系的基因有EYA1(8q13.3)[5]，SIX1(14q23.1)[6,7]和SIX5（19q13.32）[8]。大部分引起鰓耳腎綜合征譜系的是一個與人類同源的“果蠅眼缺失”基因叫做EYA1基因。鰓耳腎譜系中的40%是由EYA1基因突變引起的。EYA1基因位于8q13.3，是由16個外顯子編碼559個氨基酸組成的多肽[5]。脊椎動物EYA基因家族是由四個轉錄激活因子組成，它們是保證正常鰓弓和鰓板以及內(nèi)耳毛細胞和神經(jīng)元形成的關鍵。EYA1基因在腎臟的早期發(fā)育中也起著重要的作用。

1 資料與方法

1.1 倫理聲明

患者及家系成員均收集于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，家系成年成員及未成年成員監(jiān)護人均簽署了知情同意書，本研究得到了哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 患者資料

先證者是一名來自黑龍江省的8歲女孩，因為聽力及言語障礙2018年3月轉診到哈醫(yī)大一院兒童聽力診斷中心。通過詳細的病史采集，體格檢查，聽力檢測，耳部CT和腎臟超聲以及腎臟功能檢查，我們收集到5位健在家系成員的詳細信息，并繪制家系系譜圖（圖1）。

圖1 家系系譜圖Fig.1 Pedigree of a family

1.3 基因檢測

1.3.1 樣本制備

采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K_2)抗凝管留取家系成員（先證者IIIa、先證者妹妹IIIb、先證者母親IIb、先證者舅舅IIa、先證者父親IIc）外周血2 mL。采用德國Qiagen公司的DNA抽提試劑盒提取家系成員基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢DNA質(zhì)量。

1.3.2 捕獲測序

采用超聲波細胞打斷儀片段化基因組DNA至約150～200 bp，末端修復（采用Kapa末端修復酶）后進行樣本純化（采用AMPure磁珠去除大片段以及各種雜質(zhì)）并使用KAPA A-Tailing Buffer和KAPA A-Tailing Enzyme在DNA 3′端添加A堿基，然后使用KAPA DNA Ligase和KAPA Ligation Buffer將特異Adapter連接到DNA片段上，最后進行文庫擴增，完成文庫制備。

1.3.3 雜交捕獲

將制備好的DNA文庫樣本采用芯片進行雜交捕獲，用磁珠對雜交產(chǎn)物進行捕獲，然后通過洗脫去除非捕獲目的基因和其它雜質(zhì)，并進行Qubit對文庫核酸進行核酸定量與片段大小的質(zhì)控。

1.3.4 測序

對質(zhì)控合格的文庫采用hiseq 2500平臺標準化上機測序。

1.3.5 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

測序下機后的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina測序操控軟件（Sequence Control Software，SCS）進行實時的分析處理并判定數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

去除測序接頭以及引物序列后過濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量，經(jīng)過質(zhì)量控制之后得到的高質(zhì)量的Clean Data。后使用基因組分析工具包（Genome Analysis ToolKit，GATK）進 行 variation calling分析。經(jīng)過以上操作后，將得到的SNV和Indel突變位點與正常人群及已知致病人群數(shù)據(jù)進行比對（dbSNPA、ESP6500、PVFD、ExAC、HGMD、本地人數(shù)據(jù)庫等），最終將符合千人基因組頻率＜5%且本地人群頻率＜2%條件的突變點判定為可能致病的基因突變點并匯總。

結合家系患病情況將符合孟德爾遺傳的突變位點參照ACMG指南，進一步使用SIFT、Polyphen-2、Mutationtaster等蛋白質(zhì)功能預測軟件，預測篩選出變異對蛋白結構和功能有影響的突變點，分析包括進化保守、對剪切位點變化、蛋白質(zhì)特征的喪失和可能影響mRNA量的變化等。最終將變異分類為致?。≒athogenic）、可能致?。↙ikely Pathogenic）、臨床意義不明（Uncertain Significance）、可能良性（Likely benign）、良性（benign）的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)/Indel/exon基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）。

1.3.7 一代測序驗證

采用BI 3730XL測序儀將二代測序得到的高度可疑變異位點，在患者及其他成員中進行驗證，同時對100名正常人進行對照實驗，基因序列分析采用DNASTAR軟件進行序列分析和比對[9]。

2 結果

2.1 臨床檢測結果

系譜圖中IIIa是先證者，查體可見她有雙側耳前瘺管（圖2A），雙側鰓裂囊腫（圖2B）。純音聽力圖顯示雙耳重度感音神經(jīng)性聾（圖3A），現(xiàn)佩戴助聽器可以進行日常交流。中耳CT未見明顯異常。IIIb是先證者的妹妹，2歲，查體可見她有雙側耳前瘺管，雙耳前贅，雙側小耳畸形（圖2C）以及雙側鰓裂瘺管（圖2D），客觀聽力檢查顯示雙耳重度感音神經(jīng)性聾（圖3C），現(xiàn)佩戴助聽器輔助聽力。中耳CT可見雙側前庭導水管擴大。IIb是先證者的母親，35歲，查體可見她有雙側耳前瘺管（圖2E），因右頸側反復腫痛行右頸部腫物切除術，術后病理證實為第二鰓裂囊腫，現(xiàn)可見右側鰓裂囊腫術后疤痕（圖2F）。純音聽力圖顯示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾（圖3B），現(xiàn)沒有進行干預，存在言語障礙。中耳CT顯示雙側前庭導水管增寬。Ia是先證者的姥爺，十年前已故。他有雙側耳前瘺管，雙側鰓裂瘺管，極重度感音神經(jīng)性聾，未曾干預。所有健在患者都進行了腎臟超聲及腎臟功能檢查，均未發(fā)現(xiàn)異常。根據(jù)Chang[4]的臨床診斷標準，所有發(fā)病家系成員均符合鰓耳腎綜合征譜系的鰓耳綜合征的診斷。然而，先證者的舅舅（IIa）和父親（IIc）以及已故的姥姥（Ib）均表現(xiàn)正常。

圖2 （A）IIIa耳前瘺管（B）IIIa鰓裂囊腫（C）IIIb耳前瘺管（小箭頭），耳前贅（中箭頭），小耳畸形（大箭頭）（D）IIIb鰓裂瘺管（E）IIb耳前瘺管（F）IIb右側鰓裂囊腫術后疤痕Fig.2 (A)IIIa has preauricular pits(B)IIIa has branchial cleft cyst.(C)IIIb has preauricular pits,preauricular tags,microtia(Small arrow indicates preauricular pits,middle arrow indicates preauricular tag and large arrow indicates microtia).(D)IIIb has bilateral branchial cleft fistulae.（E）IIb has preauricular pits.(F)IIb has scar of right branchial cleft cyst after operation.

圖3 （A）IIIa純音聽力圖，顯示雙耳重度感音神經(jīng)性耳聾（B）IIb純音聽力圖，顯示雙耳極重度感音神經(jīng)性耳聾（C）IIIb腦干聽覺誘發(fā)電位及閾值，顯示雙耳重度感音神經(jīng)性耳聾，雙耳90dB（nHL）給聲強度下可見特異性負波（紅色圈注）。Fig.3 (A)IIIA pure tone audiogram showing severe sensorineural deafness in both ears.(B)IIb pure tone audiogram showing extremely severe sensorineural deafness in both ears.(C)IIIB auditory brainstem response and threshold,showing severe sensorineural deafness in both ears,and specific negative wave(red circle note)under 90dB(nHL)sound intensity in both ears.

2.2 分子檢測結果

全外顯子及剪切位點測序結果顯示，先證者的EYA1基因上發(fā)現(xiàn)一個未見報道的雜合突變位點，c.769C＞T(NM_000503)，該突變?yōu)闊o義突變，使257號谷氨酰胺突變成終止密碼子，經(jīng)Sanger測序驗證家系中所有發(fā)病成員均存在該突變位點，而未發(fā)病家系成員均未見該突變（圖4），家系中該變異與表型共分離。100名聽力正常人檢測結果為陰性。

圖4 家系Sanger測序圖，在所有發(fā)病成員（IIb，IIIa，IIIb陰影部分表示）的EYA1基因第9號外顯子上均發(fā)現(xiàn)一個未見報道的雜合突變位點，c.769C＞T(p.Gln257*（)陰影標注）。未發(fā)病家系成員（IIa，IIc）EYA1基因上均未發(fā)現(xiàn)該突變位點。Fig.4 Sanger sequencing of the core family.A novel heterozygous nonsense variation(c.769C＞T)in exon 9 in members with various physical anomalies(IIb,IIIa,IIIb)(shadow).The normal family members harbored no mutations in EYA1（IIa and IIc）.

3 討論

鰓耳腎綜合征譜系是罕見的常染色體顯性遺傳性耳聾綜合征，在中國家系中報道較少。EYA1基因的突變最常見，占了整個鰓耳腎綜合征譜系的40%[4]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)EYA1基因上的218種突變形式（http://www.hgmd.cf.ac.uk/,更新于2019年10月）可引起鰓耳腎綜合征譜系，在不同人群中發(fā)現(xiàn)多種突變形式（例如點突變，小片段及大片段的缺失等）[10-13]。

鰓耳腎綜合征譜系的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大，但目前被普遍接受的仍是Chang[4]等2004年提出的臨床診斷標準。本研究中所有患者都符合診斷標準中的第一條“具有至少三項主要表現(xiàn)”且所有患者都缺乏腎臟表現(xiàn)，因此在臨床上可以診斷為鰓耳腎綜合征譜系中的鰓耳綜合征。隨著二代測序技術的蓬勃發(fā)展，已有學者證實高通量測序技術是遺傳性耳聾行之有效的分子診斷工具[14]，本研究利用二代測序技術對先證者進行全外顯子測序，分子診斷結果進一步驗證了臨床診斷。我們對先證者進行了基因全外顯子及剪切位點的測序，并對可疑位點進行了Sanger驗證，最終發(fā)現(xiàn)所有患者的EYA1基因第9個外顯子上均存在c.769C＞T的雜合突變，該突變?yōu)闊o義突變，使257號谷氨酰胺突變成終止密碼子，而在家系中正常成員以及100名正常人中均未發(fā)現(xiàn)該突變。既往研究已證明EYA1基因類似的功能缺失性突變可以致病[15]，根據(jù)ACMG[16]指南，可以判定此無義突變?yōu)橹虏⌒苑浅姷耐蛔儯≒VS1）。由于先證者的母親和妹妹中耳CT都顯示大前庭導水管開大，為了判斷是否同時存在其他耳聾基因突變，我們在補充實驗中又分別對先證者的母親和妹妹進行了全外顯子及剪切位點測序，結果顯示除了與先證者相同的突變外，不存在其它耳聾基因的變異。因此，EYA1基因c.769C＞T突變位點與家系表型共分離，最終確定該突變?yōu)榇思蚁档闹虏⊥蛔?，而此突變位點在既往文獻中未見報道。近些年研究表明，SIX1和SIX5基因突變也與鰓耳腎綜合征譜系相關。SIX1基因（OMIM 601205）是由Ruf等[17]在2004年首次克隆的，研究發(fā)現(xiàn)該基因在耳、腎等器官的胚胎發(fā)育中起重要作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)SIX1基因的多個突變位點可導致鰓耳腎綜合征譜系，該基因的發(fā)現(xiàn)為鰓耳腎綜合征譜系的分子診斷提供了依據(jù)。然而，SIX5基因突變與鰓耳腎綜合征譜系的關系仍存在爭議[15]。本研究對先證者進行了全外顯子及剪切位點的測序，并未發(fā)現(xiàn)SIX1和SIX5基因突變，因此可以排除該家系的鰓耳腎綜合征譜系是由這兩個基因突變所引起。

4 結論

本研究為臨床診斷為鰓耳綜合征的家系找到了致病突變，即EYA1基因c.769C＞T雜合突變，拓展了EYA1基因在鰓耳綜合征的突變譜，同時我們認為將臨床診斷和基因診斷相結合是綜合征性耳聾診斷的要點。