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        小一點(diǎn)紅醇提物對(duì)慢性盆腔炎大鼠藥效學(xué)研究

        2020-11-10 03:48:40趙丹妮何國(guó)鑫龔小見
        天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2020年10期
        關(guān)鍵詞:造模盆腔炎抗炎

        趙丹妮,何國(guó)鑫,周 欣,龔小見,程 力,劉 璇,趙 超*

        1貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2喀斯特山地生態(tài)環(huán)境保護(hù)與資源利用協(xié)同創(chuàng)新中心 3貴州師范大學(xué) 貴州省藥物質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室;4貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心;5貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴陽 550001

        小一點(diǎn)紅(Emiliaprenanthoides DC.)又名細(xì)紅背葉、挖耳草等,為菊科一點(diǎn)紅屬植物的干燥全草[1]。在我國(guó)南方地區(qū)具有悠久的藥用歷史,其性味苦涼,具有清熱解毒,活血化瘀之功效,主治跌打損傷,紅白痢,瘡瘍腫毒及抗炎消腫等[2-4]?;t片是臨床中廣泛用于治療各種急、慢性婦科炎癥疾病的中成藥,據(jù)《廣西植物志》記載,小一點(diǎn)紅與其同屬植物一點(diǎn)紅為同等藥材入藥[4-6],小一點(diǎn)紅為其的主要原料藥,但其在婦科炎癥的藥理作用研究卻鮮有報(bào)道。因此本研究以炎癥因子含量、大鼠子宮腫脹度為評(píng)價(jià)指標(biāo),探究小一點(diǎn)紅對(duì)慢性盆腔炎大鼠的抗炎作用,通過對(duì)子宮病理組織顯微觀察進(jìn)一步探究其藥效學(xué)作用,以期為小一點(diǎn)紅在抗婦科炎癥方面的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料

        1.1 藥材

        小一點(diǎn)紅藥材采自貴州省都勻市務(wù)川縣大坪鎮(zhèn),經(jīng)貴陽中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為小一點(diǎn)紅(EmiliaprenanthoideaDC.)干燥全草。

        1.2 動(dòng)物

        SD雌性大鼠56只,SPF級(jí),體重190 ± 20 g,購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)SCXK(湘)2014-0011]。

        1.3 試劑

        婦科千金片(株洲千金藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)Z43020027);苯酚膠漿(廣東光華化學(xué)廠,批號(hào)20140315);水合氯醛(酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司,批號(hào)G6806V17);腫瘤壞血因子(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)購(gòu)自上海喬羽生物科技有限公司;水為蒸餾水和超純水。

        1.4 儀器

        離心機(jī)(常州市萬和儀器制造有限公司,TDL-5A);酶標(biāo)儀(美國(guó)Moleaular Devices公司,型號(hào)Max Plus 384);十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司,型號(hào)XS105);電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特有限公司,型號(hào)DK-98-Ⅱ);倒置熒光顯微鏡(廣州市明美光電技術(shù)有限公司,型號(hào),MF53)。

        2 方法

        2.1 受試藥制備

        取干燥小一點(diǎn)紅生藥粉碎,過60目篩,稱取1 kg粗粉,90%乙醇回流提取2次(2 h/次),料液比1∶10(g∶mL),合并提取液,濾過,濃縮得浸膏,得率為19.3%。將生藥材與浸膏進(jìn)行換算,配置出高、中、低劑量(0.8、1.6、3.2 g/(kg·d))受試藥混懸液于具塞錐形瓶中,4 ℃中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2 造模

        參照《中藥現(xiàn)代研究的思路與方法》[7]盆腔炎建立方法,取健康雌性SD大鼠,7%水合氯醛腹腔注射麻醉,下腹常規(guī)消毒,于正中切口0.8~1 cm,暴露子宮,除假手術(shù)組外,其余大鼠均由注射器針頭機(jī)械損傷右側(cè)子宮壁,并由右側(cè)子宮向卵巢方向推注25%苯酚膠漿(0.05 mL/只),注畢,分層縫合關(guān)腹,消毒,術(shù)后正常喂養(yǎng)。

        2.3 分組及給藥

        造模大鼠正常飼養(yǎng)7天,除空白組和假手術(shù)組外,隨機(jī)分為5組,每組8只,即模型組、婦科千金片陽性組(0.86 g/(kg·d))、小一點(diǎn)紅高、中、低劑量組(0.8、1.6、3.2 g/(kg·d))??瞻捉M、模型組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃,連續(xù)給藥14天。

        2.4 血清中TNF-α、IL-2、IL-6水平測(cè)定

        末次給藥后禁食不禁水12 h,腹主動(dòng)脈取血,于4 ℃ 3 500 rpm離心10 min,分離血清于密封試管中,-20 ℃儲(chǔ)存,ELISA法檢測(cè)大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-2、IL-6含量。

        2.5 子宮指數(shù)測(cè)量與計(jì)算

        取血后脫頸椎處死大鼠,解剖取左側(cè)及右側(cè)子宮,稱重,并按下列公式計(jì)算各組大鼠子宮的腫脹度、腫脹率和抑制率。

        腫脹度=|m右側(cè)子宮-m左側(cè)子宮|

        2.6 組織病理學(xué)變化觀察

        將稱重后的左右側(cè)子宮浸于10%福爾馬林中固定48 h,取出后經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色、封片等步驟,于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠子宮組織病變情況,根據(jù)表3中的病變組織觀察指標(biāo)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)大鼠子宮病理組織進(jìn)行打分。

        2.7 統(tǒng)計(jì)處理

        3 結(jié)果

        3.1 小一點(diǎn)紅醇提物對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮指數(shù)的影響

        各組大鼠子宮腫脹度、腫脹率及抑制率見表1所示。與假手術(shù)組比較,空白組大鼠子宮腫脹程度與假手術(shù)組中大鼠體內(nèi)子宮腫脹程度并無顯著性差異(P> 0.05),提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致子宮腫脹;與假手術(shù)組比較,模型組大鼠子宮腫脹度增加,腫脹率升高(P< 0.01),提示慢性盆腔炎大鼠造模成功;與模型組大鼠比較,婦科千金片陽性組、小一點(diǎn)紅高、中、低劑量組大鼠子宮腫脹度、腫脹率均有所降低(P< 0.05),各組的抑制率分別達(dá)到52.43%、49.25%、56.29%和36.79%。

        表1 小一點(diǎn)紅乙醇提取物對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮腫脹度的影響Table 1 Effect of ethanol extract on uterine swelling in rats with chronic pelvic inflammatory s,n=8)

        3.2 小一點(diǎn)紅提取物對(duì)慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-6的影響

        如表2所示,與假手術(shù)組比較,空白組大鼠體內(nèi)炎癥因子含量與假手術(shù)組中大鼠體內(nèi)炎癥因子含量并無顯著性差異(P> 0.05),提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致感染和炎癥;模型組的TNF-α、IL-2、IL-6顯著增大(P< 0.01),提示實(shí)驗(yàn)中造模成功。與模型組比較,婦科千金片陽性組、小一點(diǎn)紅高劑量組(IL-2、TNF-α)、中劑量組(IL-2)、低劑量組(IL-2、TNF-α)顯著降低(P< 0.05)。

        表2 小一點(diǎn)紅乙醇提取物對(duì)慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-6含量影響Table 2 Effect of ethanol extract on serum TNF-α,IL-2,IL-6 level in rats with chronic pelvic inflammatory s,n=8)

        表3 慢性盆腔炎模型大鼠子宮組織切片病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring criteria of uterine tissue slice lesions in rats with CPID

        3.3 小一點(diǎn)紅對(duì)慢性盆腔炎子宮組織病變的影響

        如圖1所示,空白組子宮組織細(xì)胞核圓潤(rùn),排列緊密,界限清晰,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)易于分化,無組織黏連(見圖A);模型組中組織黏連,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生,細(xì)胞核破損,部分細(xì)胞核變性壞死(見圖B);假手術(shù)組中,出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞,但組織黏連破損,細(xì)胞排列緊密(見圖C);與模型組比較,陽性對(duì)照組細(xì)胞分布均勻,結(jié)構(gòu)清晰完整,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),有輕微組織破損和黏連,見圖D;與模型組比較,小一點(diǎn)紅高、中、低給藥組,細(xì)胞核破損程度減輕,細(xì)胞核較圓滑,且分布均勻,炎癥浸潤(rùn)且組織黏連程度減輕(見圖E、F、G)。

        圖1 小一點(diǎn)紅對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)的影響(×400)Fig.1 Effect of EP on the pathomorphology of uterine tissue in rats with chronic pelvic inflammation (×400)注:A:空白組;B:模型組;C:假手術(shù)組;D:陽性組;E:小一點(diǎn)紅高劑量組; F:小一點(diǎn)紅中劑量組;G:小一點(diǎn)紅低劑量組。Note:A:Blank group;B:Model group;C:Control group;D:Positive group;E:High EP dose group;F:Medium EP dose group;G:Low EP dose group.

        3.4 對(duì)慢性盆腔炎子宮組織病變形態(tài)評(píng)分分析

        對(duì)比慢性盆腔炎大鼠子宮病理形態(tài)的評(píng)分結(jié)果見表4,與假手術(shù)比較,空白組大鼠子宮組織病理形態(tài)無顯著性差異(P> 0.05),提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致子宮病理形態(tài)變化;與模型組對(duì)比,小一點(diǎn)紅中劑量給藥組對(duì)宮腔黏連、上皮細(xì)胞變性或壞死、慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)、慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分?jǐn)?shù)值均小于模型組(P< 0.05),高劑量給藥組對(duì)上皮細(xì)胞變性或壞死和內(nèi)膜充血水腫評(píng)分?jǐn)?shù)值均小于模型組(P< 0.05),低劑量給藥組對(duì)上皮細(xì)胞變性或壞死、慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)和內(nèi)膜充血水腫評(píng)分?jǐn)?shù)值均小于模型組(P< 0.05)。

        表4 慢性盆腔炎性模型大鼠子宮組織病理形態(tài)的評(píng)分Table 4 Scores of pathological morphology of uterine tissue in CPID model rats

        4 討論

        慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease,CPID)是女性內(nèi)生殖器及周圍結(jié)締組織、腹膜的慢性非特異性炎癥,是較為常見及多發(fā)的婦科疾病[9]。治療過程中單一使用抗生素治療效果不佳,無法使患者全面治愈且具有毒副作用[10,11],而中醫(yī)藥在慢性盆腔炎的治療中具有多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì),發(fā)揮出西藥不可比擬的作用[12]。在中醫(yī)理論中歸屬于“婦人腹痛”、“帶下病”、“癥瘕”、“不孕”等病癥,其主要病因歸屬為臟腑失調(diào)、勞倦過度、氣血失和、經(jīng)絡(luò)氣血受阻,故中醫(yī)藥治療該病多以清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)止痛為主[13]。小一點(diǎn)紅因其清熱解毒、活血化瘀、抗炎消腫的功效,在婦科炎癥方面具有不可忽視的開發(fā)研究?jī)r(jià)值。

        TNF-α、IL-6、IL-2被認(rèn)為是重要促炎細(xì)胞因子[14],在炎癥反映初期,體內(nèi)TNF-α含量升高,激活機(jī)體的中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)多種炎癥因子的釋放,包括IL-6和IL-2的釋放[15]。IL-6、IL-2是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì),與周身的炎癥反映有關(guān),其在體內(nèi)的含量可較確切的反映出機(jī)體的炎癥情況[16]。本研究中以小一點(diǎn)紅的乙醇提取物為供試藥對(duì)慢性盆腔炎大鼠的療效進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)小一點(diǎn)紅可以有效抑制慢性盆腔炎大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2炎癥因子的產(chǎn)生,降低大鼠子宮的腫脹度,改善子宮組織病理情況,表明小一點(diǎn)紅對(duì)慢性盆腔炎大鼠有較好的療效。本研究結(jié)果與Jiang等[4]對(duì)小一點(diǎn)紅的抗炎作用研究結(jié)果一致,均表明小一點(diǎn)紅可降低炎癥大鼠體內(nèi)的TNF-α含量,具有抑制和降低大鼠體內(nèi)炎癥的作用。同時(shí)小一點(diǎn)紅醇提物中含有綠原酸、槲皮苷等具有抗炎抗氧化等作用的黃酮類物質(zhì),且含量較大[17],進(jìn)一步證實(shí)了小一點(diǎn)紅的抗炎作用。

        在臨床中,花紅片用于治療盆腔炎性疾病后遺癥濕熱瘀結(jié)證患者療效顯著[18,19],小一點(diǎn)紅作為其原料藥,本研究中證實(shí)了其在慢性盆腔炎大鼠中抗炎作用的療效,小一點(diǎn)紅與一點(diǎn)紅在外形上相差無幾,成分相仿[4,20],且在《廣西植物志》中記載為同等藥材入藥,則提示一點(diǎn)紅和小一點(diǎn)紅可能是花紅片中治療盆腔炎疾病重要的藥效原料藥材之一。本研究為小一點(diǎn)紅藥材合理用藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù),并為花紅片在臨床中的合理利用提供參考。但小一點(diǎn)紅對(duì)大鼠體內(nèi)炎癥因子抑制通路尚未證實(shí),還有待進(jìn)一步深入研究。

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