常愛冰，劉妍如*，王 梅，唐志書，宋忠興，史鑫波，劉 峰，陳彥斌

1陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同中心 省部共建協(xié)同秦藥特色資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)陜西省創(chuàng)新藥物研究中心；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，咸陽 712083； 3陜西步長制藥有限公司，西安 710075

牛膝來源于莧科植物牛膝(懷牛膝)AchyranthesbidentataBl.的干燥根。具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨和活血祛瘀等功效[1]，臨床上常用于血滯經(jīng)閉、胞衣不下和跌打損傷等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明牛膝具有增強(qiáng)免疫、抗氧化和抗炎鎮(zhèn)痛等功能，其機(jī)理為抑制自由基的產(chǎn)生[2-7]。

作為中醫(yī)臨床常用藥物之一，其質(zhì)量優(yōu)劣直接關(guān)系到臨床用藥的安全性[8]。目前牛膝藥材的質(zhì)量控制主要參考2015版藥典對于蛻皮甾酮含量的規(guī)定。中藥有別于化學(xué)藥和生物制品，單一的感官評價、化學(xué)評價或生物評價均無法全面反映中藥的整體質(zhì)量和臨床功效[9]，多元化的交叉綜合評價模式將會成為中藥質(zhì)量評價的趨勢[10]。因此本研究以抗氧化活性作為生物活性指標(biāo)，同時結(jié)合牛膝甾酮類化學(xué)成分的含量測定結(jié)果。建立一種基于“甾酮類化學(xué)成分-抗氧化生物活性”關(guān)聯(lián)研究思路的Logistic回歸模型，為牛膝藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITYH_ClASS型超高效液相色譜儀(美國沃世特公司)：包括二元超高壓溶劑系統(tǒng)、FTN自動進(jìn)樣管理器、PDA檢測器和Empower3 色譜工作站；1510型全波長酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾公司)；Sartorius CPA225D十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品25R-牛膝甾酮(批號HS94175W2)、25S-牛膝甾酮(批號H1098998198)均購于寶雞辰光生物科技有限公司，純度≥98%；對照品β-蛻皮甾酮(批號MUST-18120209)購于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥99%；ABTS自由基試劑盒和羥自由基試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼購于上海源葉生物科技有限公司；醋酸(色譜純)購于西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；乙腈(色譜純)購于德國默克公司；水為超純水，其余試劑為分析純。

1.3 材料

牛膝藥材主要收集于河南、河北、內(nèi)蒙等地，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍副教授鑒定為莧科植物牛膝(懷牛膝)A.bidentataBl.的干燥根，憑證標(biāo)本存放于陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，具體信息見表1。

表1 21批牛膝藥材信息Table 1 Collection information for 21 batches of A.bidentata

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法

2.1 牛膝甾酮類成分含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEHC18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為0.2%乙酸水溶液(A)-乙腈溶液(B)。梯度洗脫程序?yàn)?～1 min，2% B；1～21 min，2%→22% B；21～25 min，22%→2% B；25～28 min，2% B。體積流量0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣2 μL，檢測波長為250 nm。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品制備

精密稱取β-蛻皮甾酮、25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮對照品，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.8、0.1 mg/mL對照品溶液，備用。

2.1.2.2 供試品制備

精密稱取本品粉末(過三號篩)1 g，置具塞錐形瓶中，加水飽和正丁醇30 mL。浸泡過夜后超聲處理30分鐘，過濾，用甲醇10 mL分?jǐn)?shù)次洗滌容器及殘?jiān)?。合并濾液和洗液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度即得。

2.1.3 含量測定

將“2.1.2.1”項(xiàng)下對照品溶液及“2.1.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)樣2 μL進(jìn)行含量測定。

2.2 抗氧化生物活性指標(biāo)測定

2.2.1 ABTS自由基清除能力的測定

具體操作參照ABTS自由基試劑盒說明書，首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制得到線性方程為Y=-1.666 4x+2.285，決定系數(shù)r=0.999 2。將各批次牛膝的吸光值帶入方程即得清除能力(A1)，同理得出對照溶液的清除能力(A0)。每個樣品設(shè)三個復(fù)孔，按公式(1)計(jì)算清除率。

ABTS自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

(1)

2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻(xiàn)[11]稍作修改，用無水乙醇將DPPH配成2 mmol/L的溶液。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、樣品組與對照組，每個樣品設(shè)三個復(fù)孔。樣品組中加入150 μL的DPPH溶液和150 μL牛膝各批次提取液(A1)；空白組中加入150 μL的無水乙醇溶液和150 μL牛膝各批次提取液(A2)；對照組中加入150 μL的DPPH溶液和150 μL的無水乙醇溶液(A0)?；靹颍覝叵卤芄忪o置30 min，用酶標(biāo)儀測定517 nm處吸光值。按公式(2)計(jì)算清除率。

DPPH自由基清除率=

[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

2.2.3 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

具體操作參考南京建成生物工程研究所提供的羥基自由基試劑盒說明書。分別測定對照品溶液(A0)與各批次牛膝樣品(A1)吸光度值，按照公式(3)計(jì)算清除率。

羥自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

(3)

2.3 牛膝藥材等級分類

2.3.1 Logistic回歸模型建立

采用SPSS 22.0軟件建立回歸模型。首先通過主成分分析方法找到牛膝藥材等級相關(guān)的主要影響因素，該影響因素即為自變量。其次對模型進(jìn)行擬合，擬合過程如下：將21批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集分成訓(xùn)練集和測試集兩部分，對訓(xùn)練集樣品的自變量數(shù)據(jù)進(jìn)行 Logistic回歸分析。最后建立回歸模型pi=exp(βi0+β1X1+...βχn)/[1+exp(βi0+β1X1+...βχn)]，其中p為概率值，x1,…xn為自變量。然后根據(jù)該模型對測試集樣品進(jìn)行分類預(yù)測，預(yù)測結(jié)果P≥ 0.8則判定為該等級。藥材等級賦予響應(yīng)值4、3、2、1，分別代表優(yōu)(I)、良(II)、中(III)、差(IV))4個等級。

3 結(jié)果

3.3 方法學(xué)考察

3.1.1 系統(tǒng)適用性考察

將供試品溶液和對照品溶液分別進(jìn)樣2 μL，記錄250 nm波長下的色譜圖。通過比較保留時間和峰面積，可以看出甾酮類各成分的分離度均符合測定要求，結(jié)果見圖1。

圖1 牛膝藥材及混合對照品UPLC圖譜Fig.1 UPLC map of A.bidentata and its control注：1.β-蛻皮甾酮；2.25R-牛膝甾酮；3.25S-牛膝甾酮。Note:1.β-Ecdysterone;2.25R-Inokosterone;3.25S-Inokosterone.

3.1.2 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液，用甲醇逐級稀釋。分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分析，進(jìn)樣量為2 μL測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制各標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2，3個甾酮類成分在各濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

表2 3個甾酮類成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2 Regressive equations,correlation coefficients,linear ranges between three phytoecdysones

3.1.3 精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，考察精密度。結(jié)果顯示，各甾酮類成分峰面積的RSD在0.69%～1.27%之間，表明儀器精密度良好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，每隔4小時進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣24小時，考察供試品穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各甾酮類成分峰面積的RSD在0.86%～1.05%之間，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.1.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，各甾酮類成分峰面積的RSD在0.54%～0.87%之間，表明方法重復(fù)性良好。

3.1.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱定已知含量樣品約1 g，共6份，分別加入一定量的對照品溶液。按“2.1.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，各甾酮類成分的平均加樣回收率在98.56%～101.38%之間，RSD小于1%(n=6)，表明方法的準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表3。

表3 牛膝加樣回收率Table 3 Results of recovery test

續(xù)表3(Continued Tab.3)

3.2 甾酮類化學(xué)成分含量測定

21批牛膝甾酮類成分含量測定結(jié)果見表4，分析結(jié)果可知，甾酮類成分含量均符合藥典規(guī)定。但不同產(chǎn)地牛膝藥材的甾酮類含量有明顯的區(qū)別，且同一產(chǎn)地不同等級牛膝藥材含量也有略微不同。與市面上的商品等級分類有明顯區(qū)別，說明單靠形色來劃分牛膝等級存在一定的不足之處。

表4 21批牛膝的甾酮類成分的含量測定結(jié)果(n=3)Table 4 Phytoecdysones content determination for 21 batches of A.bidentata (n=3)(%)

續(xù)表4(Continued Tab.4)

3.3 抗氧化生物活性指標(biāo)測定結(jié)果

21批牛膝藥材抗氧化生物活性指標(biāo)測定結(jié)果見表5。分析結(jié)果可知，不同批次樣品生物活性均有不同程度的差異。以每批樣品中所測抗氧化指標(biāo)的總和作為牛膝的總生物活性，同理得出總甾酮類成分含量。由圖2可知，甾酮類成分含量高的一級河北、統(tǒng)河北、河南差(S10、S9、S13)，在抗氧化性測定結(jié)果中均是較差的批次。這就表明牛膝藥材抗氧化能力與甾酮類成分含量不呈單純的線性關(guān)系。所以僅靠甾酮類成分難以全面反映牛膝整體質(zhì)量。

表5 21批牛膝抗氧化生物活性測定結(jié)果(n=3)Table 5 Antioxidant biological activity for 21 batches of A.bidentata (n=3)

圖2 21批牛膝藥材的生物活性和含量測定結(jié)果Fig.2 Contents and biological activity for 21 batches of A.bidentata

3.4 牛膝等級劃分

3.4.1 主成分分析

PCA可對多變量的復(fù)雜信息進(jìn)行快速的整合[12]。本研究將提取的數(shù)據(jù)(n=3)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)入Simca-p14.1軟件，得到散點(diǎn)圖(圖A)。由圖可以看出牛膝各批次樣品有明顯分類，且分類結(jié)果與原等級不相符。進(jìn)而采用HCA聚類分析方法對各批數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可見等級間有明顯的分類距離，結(jié)果見(圖B)。由成分載荷圖(圖C)可以看出，甾酮類成分和各抗氧化因子是影響牛膝藥材等級的主要因素。

3.4.2 等級預(yù)測結(jié)果

擬合選用的訓(xùn)練集結(jié)果如下：優(yōu)級為河南牛膝(S4)和中牛膝(S7)；良級為一級河南(S14)和河北牛膝(S3)；中級為一級河北(S10)和二級內(nèi)蒙(S19)；差級為三級內(nèi)蒙(S20)和河南差級(S9)；利用SPSS 22.0軟件得到模型表達(dá)式(見公式4～7)，將測試集實(shí)測值代入下式中計(jì)算各等級的概率，結(jié)果見表5。

P優(yōu)=exp (-109.517-2.429*ABTS+0.029*DPPH+1.734*·OH+4 686.863*β-蛻皮甾酮含量+571.806*25R-甾酮含量-587.029*25S-甾酮含量)/[1+ exp (-109.517-2.429*ABTS+ 0.029*DPPH+1.734*·OH+4 686.863*β-蛻皮甾酮含量+571.806*25R-甾酮含量-587.029*25S-甾酮含量)]

(4)

P良=exp (-82.132+0.148*ABTS+6.211*DPPH-0.218*·OH-5 294.954*β-蛻皮甾酮含量-547.849*25R-甾酮含量+719.112*25S-甾酮含量)/[1+exp(-82.132+0.148*ABTS +6.211*DPPH-0.218*·OH-5 294.954*β-蛻皮甾酮含量-547.849*25R-甾酮含量+719.112*25S-甾酮含量)]

(5)

P中=exp (-246.277+2.325*ABTS-7.996*DPPH+0.086*·OH+1 896.384*β-蛻皮甾酮含量+638.24*25R-甾酮含量+480.29*25S-甾酮含量)/[1+exp (-246.277+2.325*ABTS-7.996*DPPH+ 0.086*·OH+1 896.384*β-蛻皮甾酮含量+638.24*25R-甾酮含量+480.29*25S-甾酮含量)]

(6)

P差=exp (286.408-3.501*ABTS-1.775*DPPH+1.739*·OH-2 470.817*β-蛻皮甾酮含量+146.848*25R-甾酮含量+53.502*25S-甾酮含量)/[1+exp (286.408-3.501*ABTS-1.775*DPPH+ 1.739*·OH-2 470.817*β-蛻皮甾酮含量+146.848*25R-甾酮含量+53.502*25S-甾酮含量)]

(7)

4 討論

4.1 制備方法考察

本研究對制備方法進(jìn)行了考察，主要考察溶劑種類(正丁醇、乙醇、甲醇)、溶劑濃度(90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇)和提取方式(超聲提取、回流提取)三個方面。結(jié)果表明在提取充分的條件下，“2.1.2.2”項(xiàng)下制備方法便捷且效率高，故選用該制備方法。

4.2 色譜條件的選擇

本研究比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液和乙腈-0.2%乙酸水溶液三種洗脫系統(tǒng)的分離效果。結(jié)果表明，選擇0.2%乙酸-乙腈洗脫系統(tǒng)時，各峰分離度較好且基線平穩(wěn)，故選擇此流動相?？疾炝嗣绹质捞毓镜腁CQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC?BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)兩種色譜柱，兩種色譜柱出峰靈敏度均較好，但ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱峰形更好，故選擇此色譜柱進(jìn)行色譜分析。在波長方面，PDA檢測器分析結(jié)果顯示在250 nm波長下，各參照峰色譜圖信息較為完全。因此，選用250 nm作為檢測波長。

圖3 牛膝藥材聚類結(jié)果Fig.3 Clustering results of A.bidentata注：A.PCA散點(diǎn)圖；B.2HCA-聚類圖；C.成分載荷圖。Note:A.PCA scatter diagram;B.HCA-clustering diagram;C.Loading plot.

表6 牛膝藥材等級評價結(jié)果Table 6 Grade evaluation results of A.bidentata

4.3 牛膝藥材等級評價

2015版《中國藥典》規(guī)定牛膝中β-蛻皮甾酮的含量不得低于0.03%。由表3可知，所有藥材質(zhì)量均達(dá)標(biāo)。進(jìn)一步的主成分分析結(jié)果表明，21批牛膝藥材質(zhì)量存在明顯差異，且影響因素主要表現(xiàn)在甾酮類成分含量與各抗氧化因子上。在此基礎(chǔ)上建立一種基于“甾酮類化學(xué)成分-抗氧化生物活性”關(guān)聯(lián)研究的回歸模型。通過該模型，21批牛膝藥材被分成了優(yōu)良中差四個等級。其中優(yōu)級含有二級、三級河南等批次，良級含有一級河南、一級內(nèi)蒙、三級河北等批次，中級含有一級河北、二級內(nèi)蒙等批次，差級含有三級內(nèi)蒙、統(tǒng)貨河北與河南等批次，分級結(jié)果與商品等級不全一致。目前市場上牛膝的等級主要依靠感官評價和傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)，主觀性較強(qiáng)，難以標(biāo)準(zhǔn)化界定其質(zhì)量。所以本研究認(rèn)為基于Logistic回歸模型能夠更好地劃分牛膝藥材等級。

化學(xué)定性鑒別與指標(biāo)成分檢測是現(xiàn)行中藥質(zhì)量控制主要內(nèi)容，而中藥是個復(fù)雜的體系，僅以化學(xué)成分描述其質(zhì)量優(yōu)劣顯然不夠全面。雖然已有學(xué)者建議將生物活性與化學(xué)成分關(guān)聯(lián)并用，從而更科學(xué)地評價中藥的內(nèi)在質(zhì)量[13]。但是目前仍缺乏合理的關(guān)聯(lián)方案，本研究通過Logistic回歸模型將“化學(xué)成分-生物活性”進(jìn)行了有效的關(guān)聯(lián)，為牛膝的質(zhì)量控制與評價提供了新的研究思路。