王忠澤，楊宇涵，張紅霞，杜芝芝*

1中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省野生資源植物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino)，屬于葫蘆科(Cucurbitaceae )絞股藍(lán)屬(Gynostemma)，是一種多年生草質(zhì)攀援植物，廣泛分布于中國(guó)陜西南部和長(zhǎng)江以南各省，在朝鮮、日本以及一些東南亞國(guó)家也有分布[1]。在中國(guó)，絞股藍(lán)已經(jīng)具有幾百年的食用歷史，作為蔬菜始記載于明朝(公元1368～1644年)出版的《救荒本草》一書(shū)中[2]。此外，長(zhǎng)期以來(lái)絞股藍(lán)還作為一種草藥被用于中國(guó)民間醫(yī)藥中，具有清熱解毒、止咳祛痰的功效?，F(xiàn)代大量研究表明，絞股藍(lán)具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)和抗動(dòng)脈粥樣硬化[3]等多種藥理活性。絞股藍(lán)作為一種藥食同源植物，也常被制作為絞股藍(lán)茶沖泡飲用。不同的揮發(fā)性成分以一定的比例和含量組成混合物,進(jìn)而呈現(xiàn)出不同的茶風(fēng)味。香氣是茶的靈魂,關(guān)乎茶品質(zhì)的優(yōu)劣[4]。關(guān)于絞股藍(lán)茶揮發(fā)性成分的研究已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但使用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)(SAFE)方法對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行提取卻未見(jiàn)報(bào)道。目前，SAFE在茶揮發(fā)性成分萃取中受到越來(lái)越多的重視，低真空度及低冷凝溫度控制能夠獲得自然、真實(shí)的茶湯香氣，且蒸餾過(guò)程中可除去不揮發(fā)性物質(zhì)[4]。

為了了解不同地區(qū)產(chǎn)絞股藍(lán)茶在揮發(fā)性成分方面是否存在差異，本研究采用SAFE對(duì)5個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，通過(guò)NIST.17質(zhì)譜庫(kù)檢索并運(yùn)用峰面積歸一法確定各個(gè)組分的相對(duì)含量，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)絞股藍(lán)茶揮發(fā)性成分的香氣特征進(jìn)行了詳細(xì)梳理和總結(jié)，從而為進(jìn)一步研究絞股藍(lán)茶風(fēng)味及資源的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

湖南張家界、安徽毫州、廣西金秀三個(gè)樣品均為市售絞股藍(lán)茶，分別購(gòu)自湖南張家界愛(ài)尚園茶業(yè)有限公司、安徽亳州市茗芳百花茶葉商貿(mào)有限公司和廣西金秀圣塘山天然保健品有限公司；陜西平利樣品購(gòu)于四川荷花池中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地陜西平利；云南玉溪樣品采自云南玉溪，樣品經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所陳文允副研究員鑒定，收割后切成3～5 cm小段洗凈晾干。

表1 樣品來(lái)源及名稱Table 1 Sample source and name

1.2 試劑與儀器

二氯甲烷(色譜純,美國(guó)Meridian Medical Technologies)；C7～C30的正構(gòu)烷烴(色譜純，美國(guó)SUPELCO公司)；溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)裝置(英國(guó)Edwards公司真空泵)；7890A-5795C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；HP-5色譜柱(50.0 m×0.32 mm×0.5 μm，美國(guó)安捷倫公司)；DB-wax色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)安捷倫公司)。

1.3 提取方法

準(zhǔn)確稱取絞股藍(lán)茶25 g，加入沸騰的蒸餾水500 mL密閉浸泡5 min后過(guò)濾，再用冰水迅速冷卻濾液。隨后向?yàn)V液中加入150 mL二氯甲烷，超聲30 min，再以5 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心15 min，將上清液部分倒入分液漏斗進(jìn)行分液，收集二氯甲烷相，以上步驟重復(fù)3次。合并二氯甲烷相，在35 ℃恒溫水浴條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL左右，加入過(guò)量無(wú)水硫酸鈉，過(guò)濾得到萃取液。將該萃取液置于溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)裝置(SAFE)的滴液漏斗中，并在冷阱中加入液氮，將循環(huán)水和水浴的水溫分別設(shè)為40 ℃和45 ℃，當(dāng)系統(tǒng)真空度達(dá)到1×10-4MPa時(shí)，緩慢打開(kāi)滴液漏斗活塞，萃取過(guò)程中保持樣品勻速滴下，以制取揮發(fā)性物質(zhì)萃取液。隨后在35 ℃恒溫水浴條件下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將揮發(fā)性物質(zhì)萃取液濃縮至1 mL，于-4 ℃保存，各個(gè)樣品均無(wú)重復(fù)。

1.4 GC-MS分析條件

質(zhì)譜條件：離子源：EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量：70 eV，質(zhì)核比掃描范圍：40～500m/z。

HP-5色譜柱，程序升溫條件為初始溫度50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min，分析檢測(cè)時(shí)間共67.667 min；進(jìn)樣量1 μL，不分流，載氣為高純He(99.99%)；載氣流量1.2 mL/min；溶劑延遲10 min。

DB-wax色譜柱，程序升溫條件為初始溫度50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至100 ℃，保持0 min，以2 ℃/min升至220 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min，分析檢測(cè)時(shí)間共86 min;進(jìn)樣量1 μL，不分流，載氣為高純He(99.99%)；載氣流量1 mL/min；溶劑延遲5 min。

1.5 揮發(fā)性成分鑒定

采用質(zhì)譜比對(duì)(MS)和保留指數(shù)比對(duì)(RI)相結(jié)合的方法對(duì)所分離的揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定。將GC-MS分析所得到的質(zhì)譜譜圖與NIST14質(zhì)譜譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)；通過(guò)C7～C30正構(gòu)烷烴GC-MS數(shù)據(jù)計(jì)算樣品總離子流圖中所積分的色譜峰的保留指數(shù)，與NIST Chemistry WebBook(http：//webbook.nist.gov/chemistry/)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)揮發(fā)性成分分析鑒定

采用SAFE提取結(jié)合GC-MS分析對(duì)絞股藍(lán)茶中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了鑒定，得到五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶樣品的揮發(fā)性成分總離子流圖(檢測(cè)用非極性色譜柱HP-5和極性色譜柱DB-wax)見(jiàn)圖1和圖2，為了鑒定結(jié)果的可靠性，只保留了兩種柱子同時(shí)檢測(cè)到的且與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配度高的化合物。

圖1 五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶的揮發(fā)性成分總離子流圖(非極性色譜柱HP-5)Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components of five different origins of G.pentaphyllum tea (non-polar chromatography column HP-5)

圖2 五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶的揮發(fā)性成分總離子流圖(極性色譜柱DB-wax)Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile components of five different origins of G.pentaphyllum tea (polar chromatography column DB-wax)

五個(gè)絞股藍(lán)茶樣品總共鑒定到98個(gè)化合物，如表2所示，這些化合物分別屬于9個(gè)化學(xué)類別，包括醛類、酸類、酚類、酯類、腈類、雜環(huán)化合物、酮類、醇類和烴類及其衍生物。

表2 五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶揮發(fā)性成分的保留指數(shù)和相對(duì)百分含量 Table 2 Retention index and relative percentage of volatile components in G.pentaphyllum tea from five different regions

續(xù)表2 (Continued Tab.2)

續(xù)表2 (Continued Tab.2)

續(xù)表2 (Continued Tab.2)

續(xù)表2 (Continued Tab.2)

從圖3可以看出，各個(gè)樣品化合物類別大致相同，而各類別化合物數(shù)量存在一定差異。安徽樣品包含6個(gè)化學(xué)類別，其中烴類及其衍生物揮發(fā)性化合物種類最多，為16種。除安徽樣品外，其余樣品含酯類成分最多。湖南樣品為所含揮發(fā)性類型最豐富，包含了以上9個(gè)化學(xué)類別，其中苯乙腈在其它四個(gè)樣品都未檢測(cè)到。

圖3 五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶的揮發(fā)性成分類別及各類別數(shù)量Fig.3 The five different origins of G.pentaphyllum tea volatile component categories and the number of each category

從廣西、安徽、湖南、陜西和云南樣品中分別鑒定得到48、49、50、51和50個(gè)化合物。五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)有15個(gè)共有成分(表2)，分別為苯甲醛、正辛醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、苯甲醇、苯乙醛、羅勒烯、香蘭素、二氫獼猴桃內(nèi)酯、月桂酸乙酯、2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環(huán)己基乙酸γ-內(nèi)酯、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸乙酯、十八酸乙酯。這些共有成分包括5個(gè)醛類、7個(gè)酯類、1個(gè)烴類、1個(gè)醇類、1個(gè)酮類。

采用峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性成分的相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。在五個(gè)樣品中酯類相對(duì)百分含量占比均最大，但在安徽、廣西樣品中，酯類相對(duì)百分含量第一，其次為烴類及其衍生物，而在湖南、陜西和云南樣品中，酯類相對(duì)百分含量最高，醛類第二。從表2可知五個(gè)樣品兩種色譜柱檢測(cè)結(jié)果基本一致，五個(gè)樣品二氫獼猴桃內(nèi)酯、棕櫚酸乙酯含量均很高。在廣西樣品中，含量最高的化合物為二氫獼猴桃內(nèi)酯，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對(duì)百分含量分別為6.421%和15.124%；湖南樣品二氫獼猴桃內(nèi)酯含量最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對(duì)百分含量分別為7.769%和7.467%；陜西樣品二氫獼猴桃內(nèi)酯含量也最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對(duì)百分含量分別為7.624%和8.416%；而在安徽樣品棕櫚酸乙酯含量最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對(duì)百分含量分別為12.471%和12.961%，云南樣品棕櫚酸乙酯含量最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對(duì)百分含量分別為7.096%和11.601%。除以上兩種主要揮發(fā)性成分外，廣西樣品主要成分還包括2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環(huán)己基乙酸γ-內(nèi)酯；安徽主要成分還包括四氯乙烷、5-羥甲基糠醛、咖啡因、反油酸乙酯、2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環(huán)己基乙酸γ-內(nèi)酯；湖南樣品主要成分還包括四氯乙烷、(E，E)-2，4-庚二烯醛、香蘭素、苯乙醇、月桂酸乙酯和2，3-二氫苯并呋喃、2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環(huán)己基乙酸γ-內(nèi)酯；陜西樣品主要成分還包括月桂酸乙酯、香蘭素、2，3-二氫苯并呋喃；云南樣品還包括苯甲醇、香蘭素、月桂酸乙酯和苯乙醇。

2.2 絞股藍(lán)揮發(fā)性成分氣味描述和氣味閾值

表3為五個(gè)絞股藍(lán)茶揮發(fā)性化合物的氣味描述和香氣閾值。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，共得到51個(gè)揮發(fā)物的氣味描述，其中AH樣品28個(gè)化合物，GX樣品35個(gè)化合物，HN樣品40個(gè)化合物，SX樣品35個(gè)化合物，YN樣品31個(gè)化合物。由此可見(jiàn)，HN樣品氣味組成更加豐富。在五個(gè)絞股藍(lán)樣品中，酯類化合物含量最高且種類豐富，其中二氫獼猴桃內(nèi)酯和棕櫚酸乙酯含量均很高。二氫獼猴桃內(nèi)酯具有木香和麝香氣味[11]，其香氣閾值未見(jiàn)報(bào)道；而棕櫚酸乙酯具有清香氣息[14]，其在水中的香氣閾值為2 mg/L。結(jié)合香氣成分在水中的閾值和化合物相對(duì)含量，初步分析廣西絞股藍(lán)茶的主要香氣成分為1-戊烯-3-醇、苯乙醛、4-[2，2，6-三甲基-7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯；安徽絞股藍(lán)茶的主要香氣成分為(E，E)-2，4-庚二烯醛、(+)-檸檬烯、苯乙醛、苯乙醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯；湖南絞股藍(lán)茶的主要香氣成分為(E，E)-2，4-庚二烯醛、香蘭素、二氫獼猴桃內(nèi)酯；陜西絞股藍(lán)茶的主要香氣成分為香蘭素、2，3-二氫苯并呋喃、二氫獼猴桃內(nèi)酯；云南絞股藍(lán)茶的主要香氣成分可能為香蘭素、苯乙醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯。五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶存在相同的主要香氣成分，也有各自獨(dú)特的成分，導(dǎo)致不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶的氣味存在差異。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的化合物氣味描述，絞股藍(lán)茶樣品中揮發(fā)物的特征包括“水果”、“花”、“青葉”、“木香”和“脂肪”的氣味，使絞股藍(lán)茶呈現(xiàn)出清香氣味。

表3 五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶揮發(fā)性成分的氣味描述和香氣閾值Table 3 Odor description and odor threshold of volatile components of G.pentaphyllum tea from five different origins

續(xù)表3 (Continued Tab.3)

續(xù)表3 (Continued Tab.3)

3 討論

本研究采用SAFE提取了五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶的揮發(fā)性成分，通過(guò)GC-MS分析及香氣結(jié)果表明五個(gè)樣品最主要成分都為二氫獼猴桃內(nèi)酯和棕櫚酸乙酯，但是含量有所不同，表明不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶揮發(fā)性成分存在一定差異。Blythe等[31]使用HS-SPME/GC-MS對(duì)美國(guó)密西西比州栽種的絞股藍(lán)茶揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，共檢出29種揮發(fā)性成分，主要成分為安息香醛(15.3%)、桉葉油醇(8.7%)、甲基庚烯酮(7.8%)、(Z)-3-己烯醛(7.6%)和α-紫羅蘭酮(6.3%)。而在本實(shí)驗(yàn)中，五個(gè)絞股藍(lán)茶樣品均檢測(cè)到安息香醛，但含量遠(yuǎn)低于該文獻(xiàn)報(bào)道。廣西和湖南樣品中檢測(cè)到α-紫羅蘭酮，廣西、湖南和陜西樣品中均檢測(cè)到甲基庚烯酮，桉葉油醇和(Z)-3-己烯醛在五個(gè)樣品都未檢測(cè)到。與已報(bào)道文獻(xiàn)相比較，絞股藍(lán)茶揮發(fā)性成分存在差異性，可能存在以下幾個(gè)因素：一是提取方法不同；二是由于揮發(fā)性成分對(duì)遺傳和環(huán)境因素，包括氣候，土壤狀況，該植物品種和生長(zhǎng)地點(diǎn)都很敏感，以上條件不同導(dǎo)致五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)揮發(fā)性成分存在差異。

在鑒定出的大量揮發(fā)物中，能影響食物整體香氣的揮發(fā)物很少，香氣成分的種類及含量決定著絞股藍(lán)茶的質(zhì)量。在五個(gè)絞股藍(lán)茶樣品中，酯類化合物含量最高且種類豐富，推測(cè)酯類對(duì)絞股藍(lán)茶香氣有一定貢獻(xiàn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苯甲醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、苯乙醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯是茶的關(guān)鍵香氣化合物[32]，而在絞股藍(lán)茶五個(gè)樣品中，以上四種化合物均可檢測(cè)到。二氫獼猴桃內(nèi)酯是茶葉高質(zhì)量風(fēng)味的關(guān)鍵香料之一，因其在五個(gè)不同地區(qū)絞股藍(lán)中含量很高，所以推測(cè)其對(duì)絞股藍(lán)香氣可能具有重要貢獻(xiàn)，為絞股藍(lán)茶的關(guān)鍵香氣成分之一，該化合物在食品工業(yè)和卷煙工業(yè)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)合五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶中化合物的相對(duì)含量和閾值，可知五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶都具有與真正茶相同的關(guān)鍵香氣成分，還具有它本身特有的香氣特征成分。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)云南玉溪、安徽毫州、湖南張家界、廣西金秀和陜西平利五個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明不同來(lái)源的絞股藍(lán)茶風(fēng)味不盡相同。二氫獼猴桃內(nèi)酯為五種不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶中共有關(guān)鍵成分，為絞股藍(lán)茶貢獻(xiàn)了木香氣味。此外，不同產(chǎn)地絞股藍(lán)茶還具有其獨(dú)特的特征成分。1-戊烯-3-醇、苯乙醛、4-[2，2，6-三甲基-7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮為廣西絞股藍(lán)茶貢獻(xiàn)了青葉香、花香、和木香；(E，E)-2，4-庚二烯醛，(+)-檸檬烯，苯乙醛，苯乙醇為安徽絞股藍(lán)茶貢獻(xiàn)了脂肪油膩氣息、柑橘味、花香；(E，E)-2，4-庚二烯醛，香蘭素為安徽絞股藍(lán)茶貢獻(xiàn)了脂肪油膩氣息、香草味；香蘭素、2，3-二氫苯并呋喃為陜西絞股藍(lán)茶貢獻(xiàn)了香草味和花香；香蘭素、苯乙醇為云南絞股藍(lán)茶貢獻(xiàn)了香草味和花香。絞股藍(lán)茶作為茶飲風(fēng)味俱佳，且有多種保健功效，預(yù)示絞股藍(lán)具有很好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。因此，本研究為絞股藍(lán)茶風(fēng)味物質(zhì)的深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為絞股藍(lán)茶的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。