董惠娟，郭羽軒，王 鑫，史浩楠，劉 濤*，趙 軍

1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830011；2新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；3新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830004

肝纖維化是多種原因所致慢性肝損傷不斷發(fā)展的病理結(jié)果，主要表現(xiàn)為以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟過度沉積，如不經(jīng)治療，可導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生[1]。肝纖維化是可逆的，而肝硬化是不可逆的。因此，尋找防治肝纖維化的藥物仍然是肝病防治的重點(diǎn)之一。傳統(tǒng)中藥以其高效低毒的特點(diǎn)在抗肝纖維化方面顯示了良好的效果，從中尋找具有顯著療效的有效成分亦已成為抗肝纖維化藥物研發(fā)的有效途徑。近年來，從中藥材中發(fā)現(xiàn)了龍膽苦苷、姜黃素、川芎嗪等多種成分具有較好的抗肝纖維化作用，作用機(jī)制與其抗氧化、抗炎以及NF-κB等相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)[2,3]。睡蓮花，睡蓮科植物雪白睡蓮Nymphaeacandida的干燥花蕾，主產(chǎn)于新疆伊犁、博湖等地，是維吾爾藥復(fù)方制劑炎消迪娜爾糖漿的主要組分之一，具有消炎止咳、降熱養(yǎng)肝等功效[4]。黃酮類化合物是其主要的活性成分。前期研究建立了睡蓮花總黃酮的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該有效部位對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有較好的保護(hù)作用[5,6]?；诖耍疚耐ㄟ^CCl4致小鼠肝纖維化模型評(píng)價(jià)NCTF的抗肝纖維化作用及其初步的作用機(jī)制，以期為該有效部位的深入開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠72只，體重18～22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(新)2018-0002，使用許可證號(hào)為SYXK(新)2017-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：No.65000700001119。飼養(yǎng)條件為：室內(nèi)溫度22～23 ℃，濕度為40%～50%，換氣良好，環(huán)境清潔，無外來傳染源，自由飲食和飲水。

1.1.2 主要試劑

睡蓮花總黃酮(NCTF)按文獻(xiàn)[5]方法自制，純度為59.12%；秋水仙堿片(批號(hào)190410，西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司)；分析純四氯化碳(批號(hào)20190220，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；小鼠透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒(批號(hào)190807376、190812643，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；小鼠III型前膠原(PCIII)、IV型膠原蛋白酶(IV-C)ELISA試劑盒(批號(hào)20190810、20190820，北京江萊試劑公司)；羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)試劑盒、4%多聚甲醛固定液和Masson三色染色試劑盒(批號(hào)20190902、20190520、20190401，北京索萊寶試劑公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

Imagic-V7全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；BS 124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)； HZQ-C全濕恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ABI7500 FAST熒光定量PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystems)；BIO-RadC1000 Touch梯度PCR儀(美國(guó)伯樂生物科技)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模及給藥

參照文獻(xiàn)[7]方法，72只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組(0.1 mg/kg)、NCTF低中高劑量組(50、100、200 mg/kg)，每組12只。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，除正常組注射橄欖油溶液外其余各組小鼠腹腔注射10%CCl4橄欖油溶液，每周兩次。實(shí)驗(yàn)次日按設(shè)定劑量(供試藥物溶解于0.5%CMC-Na溶液)灌胃給藥，每日1次，連續(xù)8周，期間不限制飲食和飲水。末次給藥16 h后，眼眶取血，靜置40 min后，3 000 rpm離心15 min，取血清凍存于-80 ℃冰箱待檢。頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟和脾臟。取肝臟三角葉部分用預(yù)冷0.9%生理鹽水沖洗其表面血液，再置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理學(xué)觀察；錫箔紙包裹剩余肝臟放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.2.2 血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定

采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清AST、ALT和ALP含量；ELISA法檢測(cè)血清HA、LN、PCIII、IV-C、IL-6和TNF-α水平。

1.2.3 肝組織Hyp水平測(cè)定

按試劑盒說明書，生化法檢測(cè)肝臟組織Hyp的含量。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)小鼠肝臟組織中IKKα、IκBα和NF-κB p65表達(dá)

取新鮮小鼠肝臟組織100 mg，Trizol抽取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH作為內(nèi)參，引物信息見表1。

表1 引物序列 Table 1 Primer sequences

1.2.5 病理組織學(xué)觀察

常規(guī)制作蠟塊切片，切片進(jìn)行HE染色和Masson染色，觀察肝臟切片中的肝細(xì)胞損傷及膠原纖維分布，并根據(jù)文獻(xiàn)中肝纖維化評(píng)分[8]進(jìn)行Masson染色分級(jí)：0級(jí)，正常，無纖維化表現(xiàn)；I級(jí)，在匯管區(qū)出現(xiàn)纖維結(jié)締組織或匯管區(qū)處有擴(kuò)大，纖維結(jié)締組織有向肝小葉發(fā)展的傾向；II級(jí)，纖維結(jié)締組織超過小葉的2/3并伴有I級(jí)改變，增生明顯；Ⅲ級(jí)，肝小葉中央靜脈周圍出現(xiàn)明顯的纖維結(jié)締組織進(jìn)入；IV級(jí)，纖維結(jié)締組織在肝全小葉呈多處彌漫性增生，甚至有假小葉出現(xiàn)，并伴有Ⅲ級(jí)病理變化。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般狀態(tài)

正常組小鼠精神狀態(tài)良好、食欲旺盛、毛發(fā)光澤。模型組小鼠精神萎靡、毛色黯淡、易激惹、食量減少、體型消瘦，且死亡率達(dá)到了33.3%。推測(cè)死亡原因?yàn)镃Cl4反復(fù)刺激導(dǎo)致肝損傷嚴(yán)重并發(fā)嚴(yán)重腹水，出現(xiàn)腸粘連。NCTF低劑量組小鼠精神不佳、活動(dòng)量減少，死亡3只，死亡原因與模型組類似。NCTF中、高劑量組小鼠食欲良好、毛色正常、進(jìn)食攝水稍有增加、精神正常，且隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，體重增加顯著(表2)。中、高劑量的NCTF(100、200 mg/kg)還可顯著降低肝纖維化小鼠的肝臟指數(shù)(P<0.05)；對(duì)脾臟指數(shù)也有降低作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表2 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠體重變化的影響Table 2 Effects of NCTF on body weight in CCl4 induced liver fibrosis in

表3 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠臟器指數(shù)影響Table 3 Effects of NCTF on organ index in CCl4 induced liver fibrosis in

2.2 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠血清ALT、AST、ALP水平及肝組織Hyp含量的影響

如表4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清AST、ALT、ALP水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明CCl4反復(fù)刺激導(dǎo)致了肝損傷。中、高劑量組的NCTF(100、200 mg/kg)及秋水仙堿可顯著降低血清AST、ALT、ALP水平(P<0.01，P<0.05)。高劑量組NCTF還能顯著降低CCl4損傷小鼠肝組織中Hyp的含量(P<0.05)。結(jié)果說明NCTF具有保護(hù)肝臟的作用。

表4 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠血清ALT、ALP、AST水平及肝組織Hyp含量的影響Table 4 Effects of NCTF on the serum ALT,ALP and AST levels as well as hepatic tissue Hyp content in CCl4 induced liver fibrosis in

2.3 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠血清LN、HA、PCIII、IV-C水平的影響

如表5所示，與正常組相比，模型組小鼠血清HA、LN、PCIII、IV-C含量升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，NCTF(50、100、200 mg/kg)能顯著降低肝纖維化小鼠血清PCIII水平(P<0.01)，且呈劑量效應(yīng)依賴關(guān)系；中、高劑量組的NCTF能明顯降低小鼠血清LN和IV-C水平(P<0.01，P<0.05)。NCTF還能降低肝纖維化小鼠血清HA水平，但與模型組相比只有高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。結(jié)果說明了NCTF具有抗肝纖維化的作用。

表5 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠血清LN、HA、PCIII、IV-C水平的影響Table 5 Effects of NCTF on the serum LN,HA,PCIII and IV-C levels in CCl4 induced liver fibrosis in

2.4 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠血清中TNF-α、IL-6含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α和IL-6含量明顯升高。NCTF中、高劑量組(100、200 mg/kg)及秋水仙堿組(0.1 mg/kg)均能明顯降低CCl4引起的促炎癥因子TNF-α、IL-6釋放(P<0.01)(表6)。結(jié)果說明NCTF可通過抑制促炎細(xì)胞因子的釋放發(fā)揮抗肝纖維化作用。

表6 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響Table 6 Effects of NCTF on the serum TNF-α and IL-6 levels in CCl4 induced liver fibrosis in

2.5 NCTF對(duì)肝纖維化小鼠肝臟組織中IKKα、IκBα和NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中IKKα、IκBα和NF-κB p65 mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，NCTF各劑量組小鼠肝組織IKKα、IκBα和NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05、P<0.01)。結(jié)果表明NCTF可通過影響NF-κB信號(hào)通路改善肝纖維化的進(jìn)程(表7)。

表7 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠組織IKKα、NF-κB p65和IκBα mRNA表達(dá)的影響Table 7 Effects of NCTF on IKKα,NF-κB p65 and IκBα mRNA expression in CCl4 induced liver fibrosis in

2.6 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠肝臟病理組織學(xué)影響

HE染色觀察如圖1所示，正常組小鼠肝臟形態(tài)未見異常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見變性壞死的肝細(xì)胞。模型組小鼠纖維間隔分割肝匯管區(qū)形成假小葉，有明顯的肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，異常肝細(xì)胞增殖并出現(xiàn)水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。NCTF給藥組與秋水仙堿組炎性浸潤(rùn)、肝細(xì)胞壞死程度減輕，假小葉相比于模型組明顯變少。

圖1 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響(HE染色，× 100)Fig.1 Effects of NCTF on the liver pathological changes in CCl4 induced liver fibrosis in mice (HE staining,×100)

Masson染色如表8和圖2所示，模型組出現(xiàn)大量藍(lán)色纖維條索形成的假小葉包繞匯管區(qū)，可見大量壞死肝細(xì)胞形成的空泡。NCTF中、高劑量和秋水仙堿組可顯著降低肝臟組織的膠原分泌及肝纖維化水平，且抗肝纖維化效果優(yōu)于低劑量組：匯管區(qū)周圍藍(lán)色纖維條索較模型組明顯減少。

圖2 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠肝組織膠原纖維改變的影響(Masson染色，×100)Fig.2 Effects of NCTF on the liver collagen fiber changes in CCl4 induced liver fibrosis in mice (Masson staining,×100)

表8 NCTF對(duì)CCl4致肝纖維小鼠肝組織Masson病理分級(jí)分析Table 8 Effects of NCTF on the Masson grades analysis in CCl4 induced liver fibrosis in mice

3 討論

本文采用CCl4致小鼠肝纖維化模型探討NCTF的抗肝纖維化作用。CCl4作為外源性毒物，在體內(nèi)可代謝成導(dǎo)致肝損傷的三氯甲基自由基，以CCl4反復(fù)刺激機(jī)體可造成其持續(xù)的肝損傷，繼而引發(fā)肝纖維化的發(fā)生[9,10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腹腔注射10%CCl4八周后，模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的肝細(xì)胞壞死、匯管區(qū)混合炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肝纖維化，說明造模成功。NCTF給藥組減少了CCl4引起的膠原纖維增生和肝細(xì)胞變性，減少了肝臟切片中炎性細(xì)胞分布。肝細(xì)胞受損壞死時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的AST、ALT進(jìn)入血清中；ALP升高，可能是由于肝細(xì)胞受損、微膽管梗阻所致，故這些指標(biāo)的含量可反映肝細(xì)胞受損情況[11]。NCTF能降低肝纖維化小鼠血清ALT、AST、ALP含量以及促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平。肝病患者血清HA、LN、PCIII、IV-C及肝組織Hyp含量能反應(yīng)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，對(duì)早期肝纖維化的診斷有重要意義[12]，NCTF給藥組小鼠血清HA、LN、PCIII、IV-C水平及肝組織Hyp含量低于模型組，結(jié)果說明NCTF具有抗肝纖維化作用。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB存在于細(xì)胞的胞質(zhì)中，并在激活時(shí)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮調(diào)控下游因子作用。NF-κB信號(hào)通路活化引起IKKα、NF-κB p65、IκBα等參與炎癥、免疫應(yīng)答等重要基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、自由基等炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生，致使炎癥細(xì)胞募集、肝細(xì)胞增殖，并最終導(dǎo)致自發(fā)性肝纖維化發(fā)展[13,14]。肝纖維化患者肝組織中NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，且與肝纖維化程度成正相關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)NCTF各劑量組小鼠肝組織IKKα、IκBα和NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低。因此，NCTF可通過影響NF-κB信號(hào)通路改善肝纖維化的進(jìn)程，達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用。以上結(jié)果表明NCTF具有明顯的抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制可能與其抗氧化、抑制膠原纖維生成及阻抑NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。