孫曉雪 王寧寧 李琳 榮華

【摘要】 目的：觀察石菖蒲有效成分β-細(xì)辛醚對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（growth-associated protein 43，GAP-43）表達(dá)的影響，探討β-細(xì)辛醚對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)突觸可塑性的保護(hù)作用及對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）的治療作用機(jī)制。方法：選取2019年3-4月40只2月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組，鹽酸多奈哌齊組，低劑量組及高劑量組，每組10只，選用10只相同月齡C57BL/6小鼠為空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組與模型組分別給予0.1 mL/10 g 0.9%氯化鈉溶液，鹽酸多奈哌齊組給予0.33 mg/（kg·d）鹽酸多奈哌齊，低劑量組給予β-細(xì)辛醚25 mg/（kg·d），高劑量組給予50 mg/（kg·d）β-細(xì)辛醚，五組均連續(xù)灌胃4周。采用Morris水迷宮法檢測(cè)并比較各組學(xué)習(xí)記憶能力，采用免疫熒光法檢測(cè)并比較各組海馬區(qū)GAP-43蛋白的表達(dá)變化，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)并比較各組海馬區(qū)GAP-43mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：模型組、鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組逃避潛伏期均高于空白對(duì)照組，且跨越平臺(tái)次數(shù)均低于空白對(duì)照組（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組逃避潛伏期均低于模型組，且跨越平臺(tái)次數(shù)高于模型組（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組與高劑量組逃避潛伏期均低于低劑量組（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組與高劑量組跨越平臺(tái)次數(shù)均高于低劑量組，且高劑量組高于鹽酸多奈哌齊組（P<0.05）。模型組、鹽酸多嗎哌齊組、低劑量組與高劑量組GAP-43蛋白與GAP-43mRNA表達(dá)量均高于空白對(duì)照組（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組GAP-43蛋白與GAP-43mRNA表達(dá)量均低于模型組（P<0.05）。結(jié)論：β-細(xì)辛醚具有改善AD的作用，并且作用機(jī)制與調(diào)控小鼠海馬神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)因子GAP-43的表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默病 β-細(xì)辛醚 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠 神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43

Effects of Active Ingredients of Acorus Tatarindii on GAP-43 Expression in APP/PS1 Double Transgenic Mice/SUN Xiaoxue， WANG Ningning， LI Lin， RONG Hua. //Medical Innovation of China， 2020， 17（25）： 0-025

[Abstract] Objective： To observe the effect of β-asarone on the expression of growth-associated protein 43 （GAP-43） in APP / PS1 double transgenic mice， and to explore the protective effect of β-asarone on the synaptic plasticity of APP / PS1 double transgenic mice and the therapeutic mechanism of β-asarone on Alzheimers disease （AD）. Method： From March to April 2019， a total of 40 APP/PS1 double transgenic mice with 2 month old were randomly divided into model group， Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group， with 10 mice in each group. 10 mice with C57BL/6 in the same month age were selected as blank control group. The blank control group and model group were given 0.1 mL/10 g 0.9% sodium chloride solution. The Donepezil Hydrochloride group was given 0.33 mg/（kg·d） Donepezil Hydrochloride. The Low-dose group was given 25 mg/（kg·d） β-asarone. The high-dose group was given 50 mg/（kg·d） β-asarone. All the five groups were given gavage for 4 weeks. The learning and memory ability of each group were detected and compared by Morris water maze method. The expression of GAP-43 protein of each group were detected and compared by immunofluorescence method. The expression of GAP-43 mRNA in hippocampus of each group were detected and compared by RT-PCR. Result： The escape latency of model group， the Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were higher than that of blank control group， and the number of crossing the platform were lower than that of the blank control group （P<0.05）. The escape latency of the Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were lower than that of model group， and the number of crossing the platform were higher than that of model group （P<0.05）. The escape latency of the Donepezil Hydrochloride group and the high-dose group were lower than that of low-dose group （P<0.05）. The number of crossing the platform in the Donepezil Hydrochloride group and the high dose group were higher than those in the low-dose group， and the high dose group was higher than the Donepezil Hydrochloride group （P<0.05）. The expression levels of GAP-43 protein and GAP-43 mRNA in the model group， Domperidone Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were higher than those in the blank control group （P<0.05）. The expressions of GAP-43 protein and GAP-43 mRNA in the Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were lower than those in the model group （P<0.05）. Conclusion： β-asarone has the effect of improving AD， and the mechanism of action is related to the regulation of the expression of GAP-43， a synaptic plasticity-related factor in hippocampus of mice.

[Key words] Alzheimers disease β-asarone APP/PS1 double trangsgenic mice GAP-43

First-authors address： The Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.25.006

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是與機(jī)體開始出現(xiàn)老化有很大關(guān)聯(lián)的一種中樞神經(jīng)退行性疾病。由于當(dāng)今世界人口老齡化趨勢(shì)越來越嚴(yán)重，除腫瘤及心血管疾病外，阿爾茨海默病現(xiàn)已是最為嚴(yán)重的老年人疾病及導(dǎo)致死亡的主要因素[1]。AD典型病理特征主要為細(xì)胞外部形成老年斑、細(xì)胞內(nèi)部纖維纏結(jié)以及在腦組織中積聚大量Aβ-蛋白的現(xiàn)象，能夠?qū)ι窠?jīng)突觸的完整性和可塑性起到一定的破壞作用，使部分突觸丟失及功能喪失[2-3]。阿爾茨海默病早期明顯病理表現(xiàn)主要有腦部突觸喪失，突觸發(fā)生損害為記憶出現(xiàn)障礙的基礎(chǔ)[4]。目前對(duì)于AD的治療效果并不十分理想，不能夠從根本上達(dá)到治療該疾病的效果。依據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究可得知，中藥石菖蒲具有很好的鎮(zhèn)靜、益智健腦、抗抑郁等作用，在臨床中被經(jīng)常用于治療AD、癲癇、腦中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要成分為β-細(xì)辛醚[5]。因此，本研究通過觀察β-細(xì)辛醚對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（AD模型小鼠）生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（growth-associated protein 43，GAP-43）表達(dá)的影響，從突觸可塑性角度來探討石菖蒲主要成分β-細(xì)辛醚對(duì)AD疾病的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取2019年3-4月雄性2月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只，另選取同源同月齡相同遺傳背景C57BL/6小鼠10只。購(gòu)于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCK（蘇）2015-0001。飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室。

1.1.2 藥物與試劑 β-細(xì)辛醚由天津一方科技有限公司提供（CAS：00011017-T9K），鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrchloride tablets，DHT）由衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司提供（CAS：C14200012042），GAP-43一抗抗體由SANTA 公司提供（CAS：sc-33705）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只隨機(jī)分為模型組、鹽酸多奈哌齊組，低劑量組及高劑量組，每組10只，10只C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組與模型組分別給予0.1 mL/10 g 0.9%氯化鈉溶液;鹽酸多奈哌齊組給予0.33 mg/（kg·d）鹽酸多奈哌齊;低劑量組給予β-細(xì)辛醚25 mg/（kg·d）;高劑量組給予50 mg/（kg·d）β-細(xì)辛醚。五組均連續(xù)灌胃4周。

1.2.2 學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) 灌胃4周后，應(yīng)用水迷宮方法對(duì)各組進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。采用直徑為150 cm，高為60 cm的圓形不銹鋼水池，內(nèi)置高為40 cm，底面為6 cm×10 cm無色有機(jī)玻璃平臺(tái)（安全平臺(tái)）。中心作為原點(diǎn)，在水池四周側(cè)壁上標(biāo)記東、南、西、北4個(gè)方向并作為進(jìn)入水池點(diǎn)。安全平臺(tái)放入水池中，方向?yàn)槲髂舷笙拚芯喑貍?cè)壁22 cm處，注水，水溫調(diào)控為（22.0±1.0）℃，加入適量奶粉，使水呈乳白色。安全平臺(tái)低于液面1 cm，練習(xí)期間周圍保持安靜，參照物不發(fā)生變化。（1）定位巡航實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5 d，4次/d，選取東側(cè)為作為進(jìn)入水池的點(diǎn)，自動(dòng)攝像系統(tǒng)記錄小鼠尋找安全平臺(tái)時(shí)間（逃避潛伏期）設(shè)定時(shí)間為60 s。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)。在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤出水下安全平臺(tái)，在相同的入水點(diǎn)，小鼠面向水池壁方向放入水中，拍攝小鼠在沒有安全平臺(tái)的情況下尋找記憶中安全平臺(tái)的次數(shù)（跨越平臺(tái)次數(shù)），設(shè)定時(shí)間為60 s。

1.2.2 免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)各組海馬CA3區(qū)GAP-43蛋白表達(dá) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后斷頸法處死小鼠，冰上快速剝離海馬組織，多聚甲醛溶液固定24 h。將組織切片至于甲醇溶液中室溫浸泡10 min，清洗液反復(fù)沖洗3次，3 min/次，高壓修復(fù)2 min后冷卻至室溫，37 ℃條件下免疫血清封閉30 min，低價(jià)適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液，4 ℃過夜。次日，PBS溶液沖洗切片后，滴加二抗工作液，避光反應(yīng)40 min，中性甘油封片，拍攝圖片。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)各組海馬區(qū)GAP-43mRNA表達(dá) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，冰上快速取腦，迅速剝離海馬，應(yīng)用眼科剪，將小鼠海馬組織剪成乳糜狀，按要求比例，每50 mg海馬組織加入1 mL的TRIzon試劑，使用移液器將液體吸入到預(yù)先高壓處理過的EP管中。加入氯仿，每使用1 mL的TRIzon試劑加入0.2 mL的氯仿，將EP管蓋蓋好后，使用渦旋儀劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。加入DEPC水30 ?L，使RNA充分溶解，配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠，吸取2 ?L的RNA樣品，加入1 ?L的上樣緩沖液，混勻加入配好的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，鑒定所提RNA的純度及完整性。在冰上配制反應(yīng)體系試劑，在ABI7300熒光定量PCR儀器上進(jìn)行PCR的反應(yīng)，按照說明書設(shè)置PCR的擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)。由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成引物，引物序列如下，GAP-43：Forward：5-TGAGCCTGTCCTCTCCTACC-3;Reverse：5-CTCGCCATAACAACACCAAG-3;β-actin：Forward：5-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3;Reverse：5-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析與處理，通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，F(xiàn)old change=2-ΔΔCt，WhereΔΔCt=（Cttarget gene-Ctβ-actin）-（Ctcontrol-Ctβ-actin）。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組學(xué)習(xí)記憶能力、逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)、GAP-43蛋白表達(dá)、GAP-43mRNA表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用SNK檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組學(xué)習(xí)記憶能力比較 模型組、鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組逃避潛伏期均高于空白對(duì)照組，且跨越平臺(tái)次數(shù)均低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組逃避潛伏期均低于模型組，且跨越平臺(tái)次數(shù)高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組與高劑量組逃避潛伏期均低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組與高劑量組逃避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。鹽酸多奈哌齊組與高劑量組跨越平臺(tái)次數(shù)均高于低劑量組，且高劑量組高于鹽酸多奈哌齊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

a與空白對(duì)照組比較，P<0.05;b與模型組比較，P<0.05;c與鹽酸多奈哌齊組比較，P<0.05;d與低劑量組比較，P<0.05。

2.2 各組GAP-43蛋白表達(dá)變化 模型組（1.72±0.06）、鹽酸多嗎哌齊組（1.31±0.07）、低劑量組（1.38±0.09）與高劑量組（1.35±0.08）GAP-43蛋白表達(dá)量均高于空白對(duì)照組（1.00±0.02），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組GAP-43蛋白表達(dá)量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組GAP-43蛋白表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.3 各組GAP-43mRNA表達(dá)情況比較 模型組（1.77±0.11）、鹽酸多嗎哌齊組（1.13±0.14）、低劑量組（1.21±0.11）與高劑量組（1.19±0.06）GAP-43mRNA表達(dá)量均高于空白對(duì)照組（1.00±0.06）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組GAP-43mRNA表達(dá)量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鹽酸多奈哌齊組、低劑量組與高劑量組GAP-43mRNA表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

3 討論

AD又稱老年癡呆，即是在老年期出現(xiàn)表現(xiàn)為癡呆癥狀的疾病，與年齡密切相關(guān)，多在50歲以后起病。該疾病發(fā)病的主要臨床表現(xiàn)為記憶力減退、嚴(yán)重認(rèn)知障礙且伴有不可逆的行為及社交障礙[6-7]。隨著病情加重，能夠?qū)е禄颊呤プ灾魃钅芰ι踔習(xí)韲?yán)重并發(fā)癥，最終會(huì)致死亡[8-9]。

雖然對(duì)AD的研究已經(jīng)有近百年歷史，并且國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者也提出了很多假說，并且研發(fā)出多種藥物應(yīng)用于臨床治療。但是到目前為止人們對(duì)AD發(fā)病機(jī)制并不十分明確，并且藥物治療效果不夠理想。突觸傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間聯(lián)系的主要基礎(chǔ)，神經(jīng)元對(duì)信號(hào)的接收與處理功能需要依靠突觸連接來實(shí)現(xiàn)，所以認(rèn)為突觸損傷與缺失是影響認(rèn)知功能的神經(jīng)生物學(xué)中重要因素[10]。突觸在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面、數(shù)量方面以及功能狀態(tài)調(diào)節(jié)方面的可塑性很大程度上決定神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性[11]。

GAP-43作為重要突觸蛋白，在處于軸突生長(zhǎng)和突觸發(fā)生的神經(jīng)元中呈高表達(dá)，并且在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮著不可替代的重要功能，它同突觸連接、建立及突觸損傷修復(fù)過程的關(guān)系也是十分緊密。在膜信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中，G蛋白處核心地位，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子與放大器，而GAP-43能夠調(diào)控G蛋白，通過GAP-43結(jié)合到膜內(nèi)表面氨基末端來完成，作為純化蛋白質(zhì)，GAP-43能夠起到鳥甘氨酸釋放蛋白的作用，可促使G0蛋白釋放GDP、提高GTP激酶活性及與GTP結(jié)合，因此GAP-43是軸突生長(zhǎng)、延伸的重要因子，并且可以參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)，6周胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)已存在GAP-43mRNA表達(dá)，13～14周轉(zhuǎn)移到突觸生長(zhǎng)的神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，表達(dá)最高水平會(huì)發(fā)生于出生后1周，在這之后隨著年齡增加而不斷降低[11-12]。大多數(shù)成年時(shí)腦部GAP-43含量表達(dá)水平是非常低的，但在有些腦區(qū)，如新皮質(zhì)及海馬的單胺神經(jīng)元內(nèi)，其會(huì)始終保持著較高水平的表達(dá)量。一旦發(fā)生損傷情況時(shí)，受損傷的周圍神經(jīng)元會(huì)通過側(cè)枝發(fā)芽和反應(yīng)性軸突再生進(jìn)行功能代償，導(dǎo)致GAP-43表達(dá)含量再次顯著升高，并且能夠隨著修復(fù)過程逐漸降低，因此GAP-43可作為研究神經(jīng)發(fā)育，損傷修復(fù)及神經(jīng)再生的重要探針[12-13]。GAP-43能夠在誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)方面，以及調(diào)控新的突觸連接形成時(shí)有著至關(guān)重要意義，是突觸可塑性內(nèi)在的決定因素。

中醫(yī)認(rèn)為AD病位是在腦?！侗静輦湟吩唬骸叭酥浶?，皆在腦中…”中醫(yī)早就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腦具有記憶、思維、感知的功能，AD發(fā)生是由于出現(xiàn)腦萎縮，大腦功能退化所致。《醫(yī)林改錯(cuò)》十分明確地提出“靈機(jī)記性在腦”“腦氣虛，腦縮小”“高年無記性者，腦髓漸空”[14]。在許多醫(yī)治腦部疾病的中藥方劑中，石菖蒲出現(xiàn)頻率非常高，屬于醒腦開竅類的中藥。近些年來，對(duì)中藥石菖蒲的化學(xué)成分、藥理研究、臨床應(yīng)用等方面也有了比較系統(tǒng)的研究。

中藥石菖蒲含揮發(fā)油（0.01%～2.15%）及糖類、機(jī)酸、氨基酸等，在揮發(fā)油中含有34種成分，主要為β-細(xì)辛醚（63.2%～81.2%）、α-細(xì)辛醚（3.4%～13.7%），其次為石竹烯、α葎草烯、石菖醚、細(xì)辛醛等[15-16]。石菖蒲揮發(fā)油的有效成分有很好的促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的作用。藥理學(xué)研究得知，石菖蒲的藥理作用具有鎮(zhèn)靜、防治驚厥、益智健腦、治療抑郁等作用，在臨床應(yīng)用中常被用于治療AD、癲癇、腦中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

本研究結(jié)果表明，模型組尋找跨越安全平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，同時(shí)逃逸潛伏期有所增加，入水朝向角度也發(fā)生增大的情況，而高劑量組能夠明顯改善小鼠反應(yīng)遲鈍的行為，提高跨越平臺(tái)次數(shù)，縮短逃逸潛伏期時(shí)間，縮小入水朝向角度，顯著提高癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，由此可以說明，β-細(xì)辛醚能夠改善相似于癡呆病人的行為學(xué)癥狀，對(duì)這類疾病具有一定的治療作用。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，β-細(xì)辛醚能夠降低癡呆模型小鼠海馬區(qū)GAP-43的蛋白含量和mRNA的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)突觸可塑性具有很好的保護(hù)作用。其通過調(diào)節(jié)小鼠神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)功能蛋白的變化來發(fā)揮抗AD作用，為開發(fā)防治AD的新作用靶點(diǎn)藥物提供理論研究基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-02-06） （本文編輯：田婧）