白振軍張慧宇郭敏芳

(1.山西大同大學中醫(yī)藥健康服務學院,山西大同 037009; 2.山西大同大學醫(yī)學院,山西大同 037009)

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,隨著世界人口老齡化的到來,AD 的發(fā)病率持續(xù)升高,導致了巨大的社會和經(jīng)濟負擔[1]。由于到目前為止AD 確切的發(fā)病機制還不完全清楚,因此臨床上常用的治療仍然是一些對癥治療,沒有有效的病因療法[2]。氧化應激是由于細胞過度暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)等自由基引起的,是ROS 的形成與抗氧化防御能力之間出現(xiàn)不平衡的結果,ROS 會引發(fā)細胞內信號傳導級聯(lián)的氧化爆發(fā),并且參與神經(jīng)元細胞的死亡[3-4]。眾所周知,大腦是最易受氧化損傷的區(qū)域,因為它耗氧量高并且抗氧化劑系統(tǒng)相對較弱[5],因此,氧化應激在AD 的病理過程中發(fā)揮關鍵作用[6]。這些研究證明抗氧化療法是氧化應激相關疾病例如AD 的最有前途的治療選擇之一。

有證據(jù)表明,體內排毒系統(tǒng)通過激活核因子E2相關因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號通路來對抗氧化劑的損傷而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]。Nrf2 是重要的氧化還原調節(jié)轉錄因子,激活的Nrf2 從細胞質轉移到細胞核,激活其下游一系列內源性氧化還原調節(jié)酶如血紅素加氧酶1(hemeoxygenase - 1,HO-1),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和NADPH 醌氧化還原酶1(NADPH: quinone oxidoreductase 1,NQO1)來觸發(fā)細胞保護作用[8-9],且最新研究表明Nrf2 激活不足與AD 密切相關[10]。

毛蕊異黃酮是從黃芪中分離出來的有活性的黃酮類單體成分,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用[11]。有研究表明,毛蕊異黃酮可以減輕AD 的氧化應激和炎性反應,改善 AD 的認知缺陷[12]。為了進一步研究毛蕊異黃酮的抗氧化應激和神經(jīng)保護作用,本實驗以人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 為研究對象,用H2O2構建氧化應激細胞模型,研究毛蕊異黃酮的抗氧化保護作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人源神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 細胞株由軍事醫(yī)學研究院軍事認知與腦科學研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

毛蕊異黃酮(B9938)、牛血清白蛋白(B2064)購自 Sigma-Aldrich 公 司 ( 美 國); 胎 牛 血 清(16140063)、青霉素-鏈霉素混合液(15140163)和高糖DMEM(21013024)購自Gibco 公司(美國);兔抗 Nrf2 抗 體 ( ab62352)、兔 抗 NQO1 抗 體(ab80588)、兔 抗 HO-1 抗 體 ( ab13243)、Alex Flour? 488 ( ab150077 ) 和 Alex Flour? 594(ab150080)標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(ab205718)均購自Abcam 公司(美國);RIPA裂解液(P0013B)、細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒(P0027)、4-甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑盒(ST316)、SOD 活性檢測試劑盒(S0103)和丙二醛(MDA)檢測試劑(S0131M)均購自碧云天生物技術有限公司(中國,上海)。

HERAcell 240i 二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司;LA2-5A1 型生物安全柜購自新加坡ESCO 公司;BX51 熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司;H1M 全功能酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司;SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

SY5Y 細胞用高糖DMEM 基礎培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液),置于5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),當細胞生長達80%的時候進行傳代。

1.3.2 毛蕊異黃酮濃度篩選

將指數(shù)生長期的SY5Y 細胞以每毫升5×103個的密度接種于96 孔板中。待細胞貼壁后加入不同終濃度的毛蕊異黃酮(0、0.035、0.070、0.140、0.281 μmol/mL),每個濃度設6 個復孔。24 h 后每孔加入20 μL 的 MTT 溶液(0.012 mol/L),37℃繼續(xù)孵育 3～4 h 后離心棄上清液,每孔加入150 μL 的DMSO,震蕩5 min 使結晶溶解,酶標儀檢測490 nm 波長各孔的光密度值。細胞的存活率(%)= (加藥孔-調零孔)/(對照孔-調零孔)×100%。選取可以增加細胞活性或者對細胞活性無明顯影響的毛蕊異黃酮濃度作為后續(xù)實驗的使用濃度。

1.3.3 SY5Y 細胞氧化損傷模型的建立及實驗分組

采用H2O2刺激SY5Y 細胞建立氧化損傷模型。實驗分為 3 組:PBS 對照組、H2O2(50 μmol/L)模型組、H2O2(250 μmol/L)+毛蕊異黃酮(0.035 μmol/mL)干預組。培養(yǎng)24 h 后,收集上清并離心,-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 MTT 法檢測毛蕊異黃酮對SY5Y 細胞的保護作用

藥物作用24 h 后,MTT 法檢測各組細胞活性,評估毛蕊異黃酮對H2O2致細胞損傷的保護作用。

1.3.5 氧化應激指標的檢測

取出凍存?zhèn)溆玫募毎锨逡?分別按照試劑盒說明書檢測丙二醛MDA 的水平和超氧化物歧化酶SOD 的活性。

1.3.6 免疫熒光染色檢測SY5Y 細胞中Nrf2 的核轉位情況和HO-1 的表達

為檢測毛蕊異黃酮干預SY5Y 細胞是否可以使Nrf2 表達增加并轉移到核內,采用免疫熒光染色檢測細胞中Nrf2 表達的變化,同時檢測HO-1 的表達。將細胞接種于放置好細胞爬片的24 孔板中,密度為每毫升4×105個,各組分別加入H2O2和毛蕊異黃酮,培養(yǎng)24 h 后,用4%多聚甲醛固定30 min,用含有0.3% Triton X-100 和 1% BSA 的 PBS 室溫下封閉1 h,加入兔抗小鼠Nrf2 或者兔抗小鼠HO-1 一抗,4℃孵育過夜,加488 或者594 標記的山羊抗兔IgG 二抗,室溫下孵育2 h,5%甘油封片,熒光顯微鏡掃描觀察。

1.3.7 Western blot 法檢測 SY5Y 細胞總 Nrf2、細胞核內 Nrf2、NQO1 和 HO-1 蛋白水平

藥物作用24 h 后,用RIPA 裂解液或者是細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒提取蛋白,BCA 法進行蛋白定量。采用10% SDS-PAGE 不連續(xù)凝膠分離蛋白,轉膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入用封閉液稀釋的兔抗小鼠 Nrf2 抗體(1 ∶500)、兔抗小鼠NQO1(1 ∶500)或兔抗小鼠 HO-1 抗體(1 ∶500),4℃冰箱孵育過夜,次日加入HRP 標記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000),2 h 后滴 ECL 發(fā)光液于膜上,隨后用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)顯影并分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)來表示,采用SPSS 15.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 毛蕊異黃酮濃度篩選

通過MTT 法檢測毛蕊異黃酮對細胞的毒性作用,篩選合適的藥物濃度,結果顯示毛蕊異黃酮終濃度 為 0.035 μmol/mL、0.070 μmol/mL、0.140 μmol/mL、0.281 μmol/mL 時的細胞活力分別為109.83% ± 8.57%、100.67% ± 11.64%、80.83% ±7.94%、50.33% ± 9.22%,與對照孔 99.33% ±7.34% 相比,0.035 μmol/mL 毛蕊異黃酮可以增加細胞活性(P＜0.05),隨著藥物濃度的增加,細胞活力隨之降低,0.070 μmol/mL 毛蕊異黃酮處理組的細胞活性和對照組之間無顯著性差異(P＞0.05),而0.140 μmol/mL 毛蕊異黃酮處理組的細胞活性顯著降低,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)(圖1),因此后期實驗毛蕊異黃酮選擇0.035 μmol/mL 作為藥物干預濃度。

2.2 毛蕊異黃酮對H2O2 誘導SY5Y 細胞損傷的保護作用

用 250 μmol/L H2O2刺激 SY5Y 細胞,藥物組同時加0.035 μmol/mL 毛蕊異黃酮進行處理,藥物作用24 h 后采用 MTT 法檢測細胞活性。結果顯示,與對照組相比,H2O2損傷細胞24 h 后,細胞活力明顯下降(P＜0.001),而毛蕊異黃酮能夠顯著抑制H2O2對SY5Y 細胞造成的損傷作用,細胞活力明顯增加(P＜0.01,圖2)。

2.3 毛蕊異黃酮對H2O2 誘導SY5Y 產生的SOD和MDA 的影響

測量自由基的氧化終產物丙二醛(MDA)和抗氧化酶(SOD)的量能有效的反應細胞的氧化應激狀態(tài)。與PBS 對照組比較,H2O2刺激后導致SY5Y細胞中MDA 含量明顯升高(P＜0.001),SOD 活性明顯降低(P＜0.001)。毛蕊異黃酮能夠顯著降低MDA 的水平(P＜ 0.001),提高 SOD 的活性(P＜0.01,圖3),抑制H2O2誘導的氧化應激損傷。

2.4 毛蕊異黃酮對 H2O2 誘導 SY5Y 細胞表達Nrf2 的影響

為了探討毛蕊異黃酮抑制H2O2致SY5Y 細胞氧化損傷作用的機制,本研究采用免疫熒光和Western blot 方法分析了Nrf2 的表達及其核轉位情況。免疫熒光結果顯示,PBS 對照組中的Nrf2 主要分布在細胞質中,細胞核中的含量較少,模型組細胞質和細胞核內Nrf2 含量均有所減少,而毛蕊異黃酮作用24 h 后,細胞核中的Nrf2 含量明顯增加,胞質內Nrf2 含量減少,說明毛蕊異黃酮可以促進Nrf2激活并向核內轉位。Western blot 蛋白定量結果發(fā)現(xiàn),與PBS 對照組比較,H2O2組總的Nrf2 和細胞核內Nrf2 表達均降低(P＜0.05),而毛蕊異黃酮作用后總的Nrf2 和細胞核內Nrf2 表達均明顯增加(P＜0.001,圖4)。

2.5 毛蕊異黃酮對H2O2 誘導的SY5Y 細胞抗氧化蛋白NQO1 和HO-1 表達的影響

免疫熒光檢測HO-1 的表達,同時利用Western blot 法檢測 NQO1 和 HO-1 的表達。免疫熒光結果顯示毛蕊異黃酮可以增加 HO-1 的表達,同時Western blot 結果顯示,與PBS 對照組相比,模型組細胞NQO1 和HO-1 的表達顯著降低(P＜0.01)。與H2O2組相比,毛蕊異黃酮處理組NQO1 和HO-1表達明顯增加(P＜0.05,圖5)。

圖1 不同濃度毛蕊異黃酮對SY5Y 細胞活性的影響Figure 1 Effect of different concentrations of calycosin on the activity of SY5Y cells

圖2 毛蕊異黃酮對H2O2 誘導SY5Y 細胞損傷的保護作用Figure 2 Protective effect of calycosin on H2O2 induced SY5Y cell damage

圖3 毛蕊異黃酮對H2O2 誘導SY5Y 細胞產生的SOD 和MDA 的影響Figure 3 Effect of calycosin on the level of SOD and MDA induced by H2O2 in SY5Y cells

圖4 毛蕊異黃酮對H2O2 損傷SY5Y 細胞Nrf2 表達的影響Figure 4 Effect of calycosin on the expression of Nrf2 in SY5Y cells injured by H2O2

3 討論

氧化應激已被認為是AD 的發(fā)病機制之一[13]。與其他器官相比,由于高氧消耗和缺乏抗氧化酶,神經(jīng)元更容易受到自由基的破壞[14]。在AD 患者的組織樣本中明顯出現(xiàn)了氧化應激增加的跡象,并在疾病中證明了由ROS 直接誘導或者是由脂質過氧化產物間接誘導的蛋白質修飾[15]。有研究發(fā)現(xiàn)許多用于AD 治療的化合物具有有效的抗氧化特性,例如司立吉林,黃酮類,褪黑素和類胡蘿卜素等[16]。因此本實驗研究毛蕊異黃酮的抗氧化應激效果,進一步為黃酮類藥物治療AD 提供實驗依據(jù)。

毛蕊異黃酮,從黃芪中分離出來的一種有效成分,它的極性很小,不僅可以去除游離的自由基,而且可以穿透生物膜脂質雙層去除結合的活性氧并延遲脂質生物膜的過氧化,從而提高人體的抗氧化應激能力[17]。且有研究表明,毛蕊異黃酮可以通過減少氧化應激和炎癥反應,并改善AD 模型小鼠的認知功能,并緩解AD 的癥狀[12]。也有研究顯示,毛蕊異黃酮可以減輕缺氧缺糖/復氧復糖導致的PC12 細胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[18]。然而,關于毛蕊異黃酮抗氧化應激的機制還不十分清楚。SHSY5Y 是多巴胺能神經(jīng)元細胞,被廣泛用于研究神經(jīng)退行性疾病如AD 和PD 的細胞模型[19]。因此本實驗采用H2O2刺激SH-SY5Y 建立氧化應激損傷模型,檢測毛蕊異黃酮的抗氧化作用及其可能的機制。實驗結果顯示毛蕊異黃酮濃度在0.035 μmol/mL 時,可以增加細胞活性,0.140 μmol/mL 時細胞活性開始降低,因此我們選定0.035 μmol/mL 為毛蕊異黃酮的干預濃度。同時結果顯示,250 μmol/L H2O2刺激SY5Y 細胞可以使其細胞存活率降低,而毛蕊異黃酮可以抑制H2O2誘導的細胞損傷,使細胞存活率增加,表明毛蕊異黃酮對 H2O2誘導的SY5Y 細胞氧化應激損傷具有保護作用。

圖5 毛蕊異黃酮對H2O2損傷SY5Y 細胞NQO1 和HO-1 表達的影響Figure 5 Effect of calycosin on the expression of NQO1 and HO-1 in SY5Y cells injured by H2O2

MDA 是自由基發(fā)生脂質過氧化的終產物,SOD是體內自由基的天然清除劑,可以保護機體免受氧化損傷,因此MDA 和SOD 是反應氧化應激的兩個重要指標[20]。本研究發(fā)現(xiàn),H2O2可使 SY5Y 細胞MDA 含量明顯升高,SOD 活性明顯降低。毛蕊異黃酮處理組SY5Y 細胞MDA 含量降低,SOD 活性顯著升高。顯示毛蕊異黃酮可通過增加抗氧化酶SOD的活性來抵抗H2O2所造成的氧化性損傷,表明其具有良好的抗氧化應激作用。

Nrf2/HO-1 信號通路是維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的關鍵途徑[21]。Nrf2 激活并從細胞質轉移到細胞核,進而誘導下游保護性靶基因NQO1 和HO-1 的表達,從而維持細胞內穩(wěn)態(tài)[22]。有研究表明,H2O2刺激SY5Y 細胞后,Nrf2 的轉錄活性降低,細胞核內Nrf2 及其下游分子 NQO 和 HO-1 的表達明顯降低[23]。本研究結果表明,H2O2刺激細胞后總Nrf2及核內Nrf2 的表達均較對照組減少,而毛蕊異黃酮干預能夠激活Nrf2 使其表達增加并促使其向核內轉位。同樣Western blot 蛋白定量結果表明,毛蕊異黃酮干預能夠明顯增加H2O2損傷后總Nrf2 和核內Nrf2 的表達,并且能夠明顯增強H2O2損傷后Nrf2誘導的II 相輔酶 NQO1 和HO-1 的表達,提示毛蕊異黃酮可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路發(fā)揮抗氧化應激的保護作用。

綜上所述,毛蕊異黃酮能夠抵抗H2O2誘導的SH-SY5Y 氧化損傷,其機制可能是激活了Nrf2,并促進Nrf2 向核內轉位,進而上調了其下游抗氧化酶NQO1 和HO-1 的表達,然而毛蕊異黃酮發(fā)揮抗氧化損傷和神經(jīng)保護作用的確切機制尚需進一步研究。