甘 雪劉書一王正波*

(1.昆明理工大學靈長類轉化醫(yī)學研究院,昆明 650500; 2.云南省中科靈長類生物醫(yī)學重點實驗室,昆明 650500)

線粒體自噬通常是在氧化應激、營養(yǎng)物質缺乏、細胞衰老或損傷的情況下,細胞為抵御外界刺激而產(chǎn)生的一種自我保護性行為;具體過程是當外界環(huán)境發(fā)生劇烈改變時,細胞內線粒體發(fā)生去極化損傷后,便會招募自噬小體,特異性的被包裹進入溶酶體中最終清除受損線粒體。線粒體自噬在維持線粒體的穩(wěn)定以及質量控制中具有重要作用。通過對線粒體自噬深入研究發(fā)現(xiàn),線粒體自噬的異常與心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和血液病等疾病的發(fā)生均具有緊密聯(lián)系。

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)主要是由于黑質多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失及胞質內a-突觸核蛋白(a-synuclein,a-syn)聚集成路易小體為表征的神經(jīng)退行性疾病,是當前第二大神經(jīng)退行性疾病。在PD 患者細胞中可以觀察到線粒體自噬的相關基因PRKN,PINK1,DJ-1 表達[1]。在 PD 動物模型中存在大量水腫的線粒體[2],這些腫脹可能是由于a-突觸核蛋白錯誤折疊、聚集引起的,并最終導致多巴胺能神經(jīng)元死亡[3]。此外,在PD 患者腦組織和肌肉組織中的線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ減少導致氧自由基的產(chǎn)生,以及線粒體氧化應激損傷[4],線粒體自噬及功能障礙與帕金森病的發(fā)病及進展也密切相關。

1 線粒體自噬及分類

線粒體是雙層膜結構的細胞器,其結構封閉,通過呼吸氧化鏈、脂肪酸氧化與三羧酸循環(huán)的氧化磷酸化持續(xù)供給ATP 并維持細胞的基本代謝。在線粒體生理代謝活動過程中ROS 的積累會引發(fā)線粒體的損傷,改變線粒體膜通透性,引起線粒體內細胞色素 C 的釋放并最終通過級聯(lián)反應活化Caspase 凋亡蛋白進而引起細胞凋亡。生理狀態(tài)下,細胞通過自噬途徑選擇性的降解受損線粒體來維持其穩(wěn)態(tài)。一旦線粒體自噬功能受損后,老化的線粒體會在細胞中積累,從而引發(fā)細胞變性甚至死亡。根據(jù)細胞生物學的方法通常將線粒體自噬分為三種類型:第一種類型是在營養(yǎng)缺乏的條件下,前自噬結構形成杯狀的吞噬泡,在磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)作用下,將單個線粒體包圍隔離,隨后,線粒體的外層酸化并發(fā)生去極化反應,最終在溶酶體中進行水解消化。第二種類型是受損線粒體的外膜與包含LC-3 連接蛋白的自噬體結合,發(fā)生線粒體去極化,囊泡被酸化降解。第三種類型線粒體自噬,也被稱為微線粒體自噬,與線粒體衍生囊泡(mitochondria-derived vesicles,MDVs)形成有關,被氧化的線粒體蛋白通過出芽的方式形成線粒體衍生囊泡,囊泡逐漸融合成多泡體,最后被溶酶體水解形成線粒體碎片。正常生理機能狀態(tài)下,線粒體通過自噬選擇性清除受損傷或不必需的線粒體以維持穩(wěn)態(tài)。病理狀態(tài)下,線粒體自噬出現(xiàn)異常,與神經(jīng)退行性疾病,糖尿病和腫瘤的發(fā)生有著密切關系。

線粒體自噬的關鍵步驟是待降解的線粒體和自噬泡之間的特異性識別,該過程是通過位于線粒體上的降解信號和自噬泡上的受體相互作用來介導的。線粒體自噬相關蛋白 Atg、Uth1、Aup1、NIX、PINK1 和 Parkin 等參與線粒體自噬過程,其中PINK1 和Parkin 與PD 發(fā)生相關,說明線粒體自噬與PD 疾病的形成密切相關。線粒體自噬通常可分Parkin 依賴型和Parkin 非依賴型[5],兩種不同類型的自噬途徑共同維持線粒體的穩(wěn)態(tài)。

在Parkin 依賴型線粒體自噬中,在去極化或受到損傷的線粒體中,PINK1 會在線粒體外膜大量積累,聚集的PINK1 作為傳感器招募Parkin 定位至線粒體并使其磷酸化成為活性形式,磷酸化的Parkin作為放大器使線粒體上的底物泛素化并形成多聚泛素化鏈,多聚泛素化鏈招募自噬受體OPTN 和NDP52[6],自噬受體與連接蛋白LC3 相互作用,隨后存在于LC3 上的自噬泡作用域招募自噬泡啟動線粒體自噬過程[7]。而Parkin 非依賴型線粒體自噬又分為受體介導自噬和泛素連接酶介導自噬兩種類型。在受體介導自噬過程中,幾種受體蛋白比如NIX、BNIP3、FUNDC1,其 C-末端位于線粒體外膜,N-端具有LC3 相互作用結構域(LIR),從而招募自噬小體誘導線粒體自噬過程[8]。自噬受體和Bclin1 調節(jié)因子1(AMBRA1)作為自噬的上游調節(jié)因子通過LIR 與LC3 相互作用引發(fā)線粒體自噬,其中AMBRA1 既能誘發(fā)Parkin 依賴型自噬又能介導非依賴型自噬[9]。在泛素介導線粒體自噬過程中,定位于線粒體外膜的 PINK1 招募 E3 連接酶(ARIH1)和突觸核蛋白相互作用蛋白(Synphilin-1),促使線粒體外膜底物的磷酸化和多聚泛素化的形成進而招募 LC3 和自噬泡從而引發(fā)線粒體自噬[10]。

2 線粒體自噬與帕金森病

PD 致病因素至今不明,不僅包括遺傳因素(基因易感性),同時也受環(huán)境、種族、年齡和性別等多種因素的影響,其中基因和環(huán)境的相互作用被認為是造成特發(fā)性PD 的根本原因。PD 分為家族型和散發(fā)型兩種,分別占10%～15%和85%～90%[11],其中家族型PD 有常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳兩種,家族性PD 患者通常表現(xiàn)為線粒體缺陷和自噬受損[12]。

2.1 環(huán)境毒素影響線粒體自噬及其功能

在環(huán)境這一致病因素中,人體長期暴露于鐵、銅、錳、鉛和汞等重金屬時,將造成神經(jīng)元的損傷而提高PD 的致病風險。例如,大量Fe2+在大腦中積累并發(fā)生Fenton 反應產(chǎn)生過多的羥自由基而導致神經(jīng)元線粒體發(fā)生氧化應激,造成線粒體DNA 損傷以及抑制呼吸鏈作用,最終導致神經(jīng)元的死亡[13]。同時,農(nóng)藥比如魚藤酮、1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)和殺蟲劑等主要破壞多巴胺能神經(jīng)元,造成PD 風險的增高,其中魚藤酮通過抑制線粒體呼吸鏈中復合物Ⅰ的活性而阻礙線粒體的氧化供能作用,而MPTP 則是通過損傷線粒體膜電位來影響線粒體正常生理功能,最終導致神經(jīng)元的死亡。

2.2 PD 相關基因突變影響線粒體自噬及功能的機制

到目前為止,通過全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)大約有92 個基因座與遺傳性PD 相關[14],總共約有二十幾個PD 易感基因,而在這些相關基因中對PD 影響較大的基因比如SNCA、PRKN等大多參與線粒體的自噬和功能調控過程,并且在這些基因突變的遺傳性PD 患者中存在線粒體自噬通路的損傷和線粒體功能缺陷現(xiàn)象。因此PD 相關基因的突變將會造成線粒體的功能障礙最終導致PD 的病理現(xiàn)象。下文將會對部分的PD 相關基因(表1)的突變與線粒體自噬及其功能障礙的關系做一簡要介紹。

2.2.1SNCA

SNCA基因位于4 號染色體的長臂端,對應于PARK1 和 PARK4 基因座,編碼 a-syn 蛋白,其突變、重復或三聯(lián)體均會導致常染色體顯性PD[15];SNCA基因主要有以下三種點突變形式:A53T、A30P、E46 K。a-syn 由帶正電荷的N-端、高度聚集傾向的疏水中心區(qū)域(NAC)、高酸性的C-端三部分組成,其中N-末端的前15 個氨基酸主要參與線粒體膜錨定以及擾亂膜疏水區(qū)域,而第16-30 個氨基酸殘基能與磷脂的極性基團相互反應,說明N-末端主要負責與線粒體膜結合;NAC 負責蛋白的寡聚;而C-末端具有類似伴侶蛋白活性[16]。正是由于a-syn 具有線粒體親和能力,才能使其定位至線粒體外膜并產(chǎn)生相應的生物學效應,比如影響線粒體蛋白的導入、抑制呼吸鏈內復合物Ⅰ的活性、影響線粒體動力學以及線粒體自噬過程等。

突變的a-syn 通過其N-末端定位于線粒體,并造成線粒體損傷使其功能紊亂,在影響線粒體自噬方面尤為突出[17-18],a-syn 主要通過以下幾種方式來影響線粒體自噬功能:(1)a-Syn 通過N-末端與Miro 相互作用,且上調Miro 水平,導致過量的Miro聚集于線粒體表面,延遲線粒體自噬過程[19]。(2)A53T-a-Syn 過表達激活 P38 MAPK,使 Parkin 131位的絲氨酸磷酸化,破壞其生理功能,干擾線粒體自噬[20]。(3)A53T、E46K-a-Syn 在線粒體膜上過度積累導致心磷脂暴露于線粒體外膜,從而募集LC3連接蛋白,誘導線粒體自噬[21]。在正常細胞中線粒體外膜受體TOM 負責將核編碼的線粒體蛋白運輸入線粒體基質中,然而在PD 患者死后腦組織或PD動物模型中發(fā)現(xiàn)a-syn 定位至線粒體外膜并與TOM結合而阻斷了線粒體相關蛋白的轉運途徑,導致線粒體所需蛋白不能被正常的運輸至基質中,從而造成線粒體的功能損傷[22]。隨后Reeve 等[23]人提出突變型a-syn 可能與外化的心磷脂相互作用而抑制呼吸鏈中復合物Ⅰ的活性,而復合物Ⅰ活性的下降通過級聯(lián)反應使磷酸乙酰輔酶1(ACC1)磷酸化失去酶活性,磷酸化的ACC1 抑制線粒體脂質代謝過程進而影響生物合成,造成線粒體結構的損傷甚至斷裂[24]。之前對具有毒性的a-syn 類型尚不清楚,但在Grassi 等[25]人研究中指出由a-syn 不完全降解形成的截短型a-syn 與磷酸化的ACC1 存在共定位關系,并且證明此種形式的a-syn 具有線粒體毒性,使膜去極化、誘導細胞色素C 釋放等效應。以上研究多數(shù)基于在細胞中或動物模型上過表達突變型asyn 探討其對線粒體自噬及功能障礙的影響。a-syn是路易小體的主要組成成分,同時還含有非蛋白物質(如脂質)[26]、膜性細胞器[27](如線粒體、溶酶體等)。最近研究者利用由a-突觸核蛋白纖維(a-syn PFF)處理的神經(jīng)元研究a-syn PFF 的聚集,追蹤路易小體的形成過程,動態(tài)監(jiān)測多種蛋白的變化情況。發(fā)現(xiàn)路易小體的形成會對線粒體的生理功能造成嚴重的影響,在不溶性包涵體中不僅富集了線粒體轉運蛋白,同時與線粒體動力學、線粒體凋亡途徑和能量代謝途徑(三羧酸循環(huán)、NADH 代謝等)相關的蛋白質也得到了富集[28];說明a-syn 聚集形成路易小體導致線粒體功能障礙可能是造成帕金森病的重要原因。

表1 部分PD 易感基因相關信息Table 1 A part of PD susceptibility gene related information

2.2.2PRKN

PRKN基因大小為1.3 Mb,定位于6 號染色體上,該基因的突變會增加散發(fā)性、早發(fā)性PD 的風險。PRKN編碼蛋白 Parkin 由465 個氨基酸組成,在其氨基酸序列中的第65 位絲氨酸殘基處具有泛素樣結構,即N-末端泛素樣結構域(UBL),該殘基能被PINK1 磷酸化形成具有活性的開放結構。但是在 UBL 結構域中氨基酸發(fā)生替換時會影響Parkin 的活性,比如 G12R、R33Q 和 R42P 形式的突變會抑制 PINK1 對 Parkin 的磷酸化作用;而 T55I突變形式促進Parkin 自身泛素化,從而導致Parkin蛋白的降解,這兩種具有不同作用的氨基酸替換都會抑制線粒體的自噬活動[29-30]。過表達Parkin S65 N 的小鼠中Parkin 蛋白不能被磷酸化,并且出現(xiàn)選擇性運動功能障礙,表明Parkin 蛋白第65 位氨基酸的磷酸化在PD 病理過程中具有重要地位。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相比于其他的神經(jīng)元,多巴胺能神經(jīng)元更易受到PINK1-Parkin 信號通路的影響,說明多巴胺能神經(jīng)元對線粒體應激敏感[31-32]。同時對于增殖的細胞來說,定位于線粒體內膜的Parkin 能與線粒體DNA(mtDNA)和線粒體轉錄因子A(TFAM)相互作用,從而控制線粒體的代謝和功能性活動[33]。因此,Parkin 除了在線粒體自噬通路中有重要作用外,同時也能調節(jié)mtDNA 的復制、轉錄和翻譯過程。

2.2.3PINK1

PINK1 基因定位于1 號染色體,其突變導致常染色體隱性遺傳PD,其突變形式有L347P、G411S、Q456X 和 I368N 等。PINK1 基因編碼蛋白為含有581 個氨基酸的PTEN 誘導激酶,該蛋白含有線粒體定位結構域和蛋白激酶結構域兩個核心結構[34]。PINK1 蛋白定位于線粒體外膜,在健康的線粒體中,當其轉移至線粒體內膜時受到早老素相關菱形樣蛋白(PARL)的切割失去其激酶活性,隨后N-末端被降解,不會導致線粒體的異常自噬。在損傷或去極化線粒體中,通過PINK1/Parkin 依賴性自噬通路清除受損的線粒體,防止由于受損線粒體過度積累而導致神經(jīng)細胞的死亡。然而當PINK1 發(fā)生突變時,其激酶活性、自身磷酸泛素化、與底物的結合效率以及維持蛋白穩(wěn)定性的能力均會發(fā)生變化,從而使線粒體發(fā)生功能障礙;在線粒體自噬方面表現(xiàn)得尤為突出,受損線粒體得不到有效清除,從而導致多巴胺能神經(jīng)元的死亡,最終造成PD 形成[35]。

2.2.4LRRK2

LRRK2 基因位于16 號染色體短臂端,其錯義突變常導致常染色體顯性遺傳PD[36]。LRRK2 蛋白主要由四部分組成,分別為N-末端的類錨定蛋白、富含亮氨酸的LRR 結構域、催化結構域和C-末端的WD40 結構域。LRRK2 蛋白的催化結構域中易發(fā)生突變,在2010 年所發(fā)現(xiàn)的外顯子突變體有121種[37],其中 R1441C/G/H、Y1669C、G2019S、I2020T這6 種突變是常見類型,其中G2019S 是與疾病相關的最為常見的一種突變形式[38]。在LRRK2 G2019S 突變體中出現(xiàn)神經(jīng)元營養(yǎng)不良現(xiàn)象并導致神經(jīng)元死亡,同時發(fā)現(xiàn)P62 以及LC3 向線粒體趨化引起線粒體自噬水平上升。在A53T 轉基因小鼠中,過表達LRRK2 促進a-syn 的聚集并增強其毒性作用,但是在LRRK2 敲除的小鼠中A53T-a-syn 的毒性作用會被阻斷[39];同時在a/β/γ-syn 敲除鼠的原代神經(jīng)元中,G2019S/Y1699CLRRK2 的表達所導致神經(jīng)元的死亡顯著的減少[40],說明LRRK2 與a-syn之間存在緊密的聯(lián)系,可能通過相互作用的方式影響多巴胺能神經(jīng)元的正常生理功能,但是具體通過何種機制而產(chǎn)生相互作用尚不清楚。

2.2.5DJ-1

DJ-1 基因位于1 號染色體的長臂端,該基因廣泛表達于全身組織細胞,在腦內主要表達于黑質、皮層及杏仁核中[41]。DJ-1 基因突變是導致PD 常染色體隱性遺傳的常見病因,已知突變類型有5 種,較為高發(fā)的是錯義突變、同義突變和缺失突變。DJ-1 蛋白主要存在于細胞質中,因具有分子伴侶、蛋白酶活性所以在調節(jié)細胞多種功能中具有重要作用,比如抵抗細胞氧化應激、調節(jié)轉錄翻譯和促進神經(jīng)元分支形成等[42]。在多巴胺能神經(jīng)元中,多巴胺對氧化應激敏感,而DJ-1 蛋白具有上調多巴胺合成限速酶即酪氨酸羥化酶的轉錄活性并通過氧化作用與多巴胺合成酶相互作用而促進多巴胺的合成,從而調節(jié)多巴胺的新陳代謝和動態(tài)平衡。同時DJ-1也是一種神經(jīng)保護因子,當細胞發(fā)生氧化應激時,DJ-1 能定位至線粒體并成為氧化形式與PTEN 結合后負性調節(jié)由磷脂肌醇3 激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)介導的細胞凋亡過程,實現(xiàn)DJ-1 的細胞保護作用[42]。在亞細胞水平,DJ-1 還參與線粒體的自噬、形態(tài)以及 ATP 合成等調節(jié)過程[43]。最近 Maita等[44]人進一步解析了DJ-1 的突變影響線粒體合成ATP 和自噬的過程,具體機制如下:DJ-1 通過與線粒體ATP 合成酶的β 亞基結合,抑制線粒體解偶聯(lián)過程,提高ATP 的合成效率;相反,在突變的DJ-1或在DJ-1 敲除的小鼠中線粒體解偶聯(lián)增加,ATP的合成減少,造成線粒體的去極化,而去極化的線粒體招募自噬小泡促進線粒體的自噬過程,說明若DJ-1 突變發(fā)生在多巴胺能神經(jīng)元細胞中,可以造成線粒體的過度自噬化導致神經(jīng)元的供能不足,導致多巴胺能神經(jīng)元的死亡。

2.2.6GBA

GBA基因位于1 號染色體短臂端,編碼溶酶體酶β-葡萄糖腦苷脂酶(GCase),該酶具有將葡萄糖神經(jīng)酰胺分解為神經(jīng)酰胺和葡萄糖的作用。GBA點突變導致常見的溶酶體病-戈謝氏病(GD),其雜合突變形式N370S 和L444P 是導致常染色體顯性遺傳PD 最常見的遺傳危險因素之一;相比于不攜帶突變的人群,發(fā)生GBA雜合突變人群更易形成早發(fā)性PD[45]。對成纖維細胞的內源性GCase 研究表明,相比于野生型GBA,N370S 和L444P 突變形式的GCase 其內在催化活性和合成水平降低 80% ～95%[46-47]。GBA突變引起的 GCase 表達量以及酶活性降低造成溶酶體功能障礙是導致PD 的主要原因之一,主要影響大自噬和伴侶介導自噬過程,導致聚集的a-syn 無法得到清除,最終影響神經(jīng)元的正常生理活動;并且研究還發(fā)現(xiàn)GCase 和a-syn 存在正反饋現(xiàn)象。在Collin 等[48]人的小鼠十二指腸過表達a-syn 模型中發(fā)現(xiàn)GCase 表達量降低,隨后在此模型中利用病毒載體將GBA基因遞送至十二指腸,發(fā)現(xiàn)在60 天后a-syn 的含量顯著減少,說明過量積累的a-syn 抑制GCase 表達從而加速自身聚集,形成PD 病理現(xiàn)象。

同時,GBA突變還會造成內質網(wǎng)應激、線粒體功能障礙和神經(jīng)炎癥等。在線粒體功能障礙方面,GBA突變影響線粒體蛋白導入機制、線粒體形態(tài)、線粒體融合與斷裂和線粒體自噬功能,比如,在GBAL444P 轉基因小鼠中,通過測量單個線粒體的長寬比發(fā)現(xiàn),相較于野生型小鼠,其長寬比值增高,說明GBA突變延長了線粒體長度;同時在GBAL444P 模型小鼠海馬區(qū)中發(fā)現(xiàn)線粒體分裂蛋白水平低,說明GBAL444P 使線粒體不能進行正常的裂變和融合[49];利用mt-Keima 熒光蛋白在一定波長下的熒光強度下表征線粒體向溶酶體轉移情況的功能,在神經(jīng)元中檢測到線粒體自噬能力減弱現(xiàn)象,GBA突變不僅影響Parkin 依賴性自噬,還會抑制受體介導的線粒體自噬過程[50]。因此GBA突變不僅使a-syn得不到有效的清除同時還會造成神經(jīng)元線粒體的功能障礙,最終造成神經(jīng)元無法維持正常的生理功能。

3 小結和展望

帕金森疾病作為全球第二大神經(jīng)退行性疾病,目前沒有有效的治療方式,關鍵問題還是PD 的具體發(fā)病機制尚不明確,但隨著研究的不斷深入,其致病因素正在被不斷的發(fā)掘。PD 的致病因素眾多,但是最終所導致的結果為黑質多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失和死亡而出現(xiàn)PD 非運動癥狀和運動癥狀。a-syn 的異常聚集是PD 的關鍵病理特征,其編碼基因SNCA 突變將會造成細胞的多項生理功能出現(xiàn)障礙,從而直接影響神經(jīng)元的生命活動和代謝;同時 PD 相關基因PRKN、PINK1、DJ-1 等發(fā)生突變后也會影響線粒體自噬水平和正常生理功能,最終直接或間接的誘發(fā)PD 的發(fā)生和發(fā)展。盡管,目前有很多的PD 相關基因被發(fā)現(xiàn)并對其蛋白功能有一定的闡述,但是這也只是從某些方面揭示PD的發(fā)病機制。根據(jù)眾多的研究,值得肯定的是線粒體自噬紊亂所引發(fā)的線粒體功能障礙是導致PD 發(fā)病的重要因素。因此,通過調節(jié)線粒體自噬水平使線粒體自噬維持在正常水平將成為治療PD 的關鍵靶點和思路,但這一具有挑戰(zhàn)性的治療策略還需要對線粒體自噬與PD 之間的聯(lián)系進行更加深入的研究。