吳深寶 金忠海 宋俊英 徐小宏

（1 溫州醫(yī)科大學附屬義烏醫(yī)院消化科 浙江 義烏 322000）

（2 溫州醫(yī)科大學附屬義烏醫(yī)院中藥科 浙江 義烏 322000）

（3 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院乳腺外科 浙江 杭州 310005）

膿毒癥癥是一種嚴重臨床綜合征,是炎癥反應受損的結果，以異常的生理、生物和生化過程為特征。根據(jù)一項國際性數(shù)據(jù)庫回顧分析，1995 年—2015 年，全球膿毒癥發(fā)生率的比率是437/100,000，每 100,000 例中有270 例發(fā)生嚴重敗血癥[1]。膿毒癥引起多器官衰竭增加病死率[2]。膿毒癥誘導小腸上皮細胞功能多重紊亂，包括上皮細胞凋亡增加，屏障功能障礙和細胞因子產(chǎn)生[3]。預防膿毒癥誘導的小腸細胞凋亡可以提高膿毒性腹膜炎和肺炎的存活率2 到10 倍。 柴芍承氣湯（ChaiShao Chengqi Decoction，CSCD）對缺血再灌注腸損傷有一定保護作用，減少小腸細胞凋亡[4]。盲腸結扎和穿刺（CLP）是一種設計合理，易于操作和廉價的實驗性微生物膿毒癥休克模型，也符合人類敗血癥的動物模型[5-7]。CSCD 對CLP 引起膿毒癥小腸損傷的保護作用研究極少。本研究以CLP 大鼠膿毒癥為模型載體，研究CSCD 對膿毒癥小腸損傷的保護作用及可能的機制。

1.材料與方法

1.1 動物分組及膿毒癥模型的制備

30 只雄性Wistar 大鼠，體重320 ± 30g。購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。隨機分為3 組：對照組（10只）、模型組（10 只）和中藥組（5ml/100g，10 只）。造模與給藥：實驗大鼠術前禁食12h，不禁水。中藥組術前1h 灌胃給藥，對照組和模型組給予等體積生理鹽水。采用大鼠盲腸結扎穿孔(CLP)制造膿毒癥大鼠動物模型[8]。造模6h 后處死大鼠。造模過程中及造模后各組大鼠均未死亡,存活率100%。

1.2 CSCD 的制作和使用方法

湯方由本院中醫(yī)科提供，中藥房熬制，湯方組成如下：柴胡10g，白芍10g，黃芩10g，枳實10g，厚樸10g，玄明粉(沖)10g，生大黃(后下)10g。前5 味中藥煮沸18min 后熄滅熱源，將生大黃加入浸泡2min，之后倒出湯液，再加入玄明粉，冷卻后即可使用。造模成功后中藥組按實驗要求每6h 經(jīng)口灌入1 次，劑量為5ml/100g 體質量，直至被處死為止；對照組灌入同等劑量的無菌生理鹽水。

1.3 將取好的新鮮標本，用磷酸緩沖液清洗，2.5%戊二醛重懸，1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷：epon 樹脂=2：1 滲透過夜，包埋，超薄切片，70nm，鉛鈾染色后電鏡觀察并拍照。

1.4 準確稱取小腸組織重量，按重量（g）：體積（ml）=1：9 的比例，加入9 倍體積的勻漿介質，冰水浴條件下機械勻漿，3500 轉/分，離心10 分鐘，取上清液檢測各組大鼠小腸組織中的髓過氧化物酶（MPO）。

1.5 Western blot 分析

將各組小腸組織按每20mg 組織加入150-250μl 裂解液的比例加入裂解液，提取蛋白；將各組蛋白等量上樣，經(jīng)過電泳、轉膜、封閉。根據(jù)說明書NF-κB 1：500 和GAPDH 1：1500 稀釋抗體，4℃孵育過夜。按照1：1000 稀釋HRP 標記的二抗，與膜37℃孵育1h。采用紫外投射凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應用Quantlty one 軟件進行灰度值分析。計算樣本目的蛋白灰度值/內(nèi)參基因條帶灰度值的比值，即蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件分析處理，計數(shù)資料采用率（%）表示，行χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，行t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 大鼠小腸細胞透射電鏡觀察結果

對照組：組織結構較為致密，部分區(qū)域出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，線粒體數(shù)量較多且結構清晰可見內(nèi)嵴；模型組：組織結構松散，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，線粒體數(shù)量少，崩解嚴重，形成大量空泡；中藥組：組織結構松散，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，線粒體數(shù)量較多，大量線粒體崩解，部分線粒體內(nèi)嵴清晰,見圖1。

圖1 各組小腸組織的透射電鏡觀察

2.2 大鼠小腸黏膜組織NF-κB 的表達

與對照組 相比，模型組NF-κB 表達水平明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中藥組與模型組相比，NF-κB 表達水顯著下降，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小腸黏膜組織NF-κB 的表達

2.3 大鼠小腸組織MPO 的水平

MPO 對照組表達為1.04±0.16u/克組織濕重 ，模型組為3.46±0.21U/克組織濕重，組織濕重,2.64±0.16U/克組織濕重，兩兩比較，均有統(tǒng)計學差異（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小腸黏膜組織MPO 的表達

3.討論

C S C D 是一種傳統(tǒng)中藥方劑，據(jù)報道它具有腸道屏障保護作用。本研究檢測了CSCD 對CLP 誘導的膿毒癥小腸損傷的保護作用具體分子機制。

小腸是敗血癥中敏感的器官。本研究通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠組小腸組織組織結構松散，自溶，線粒體崩解嚴重，形成大量空泡；中藥組小腸組織也表象結構松散，自溶，但線粒體崩解較膿毒癥組明顯減少，部分可見內(nèi)脊。證實CSCD 對膿毒癥引起的腸損傷有部分保護作用。

M P O 是中性粒細胞的功能標志和激活標志。中性粒細胞活化后釋放炎癥因子，引起腸組織損傷。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥時腸組織中M P O 明顯增高，表明中性粒細胞等炎癥細胞浸潤增多，C S C D 可明顯降低M P O 表達水平，提示C S C D通過抑制中性粒細胞浸潤，從而減輕小腸炎癥損傷。

已經(jīng)證明NF-κB 介導大量基因的轉錄，其產(chǎn)物在膿毒癥病理生理學中具有重要作用[9]。 缺乏NF-κB 依賴性基因的小鼠減少膿毒性休克和膿毒癥相關病死率[10]。本研究表明，在C L P 誘導的膿毒癥大鼠小腸組織中，N F-κ B 表達明顯升高，CSCD 抑制大鼠小腸組織中NF-κB 的表達，提示CSCD 對NF-κB 信號傳導途徑有抑制作用，從而減輕膿毒癥小腸損傷。

總之，本研究的結果表明，CSCD 改善膿毒癥小腸組織損傷，CSCD 的這種保護作用與其抑制中性粒細胞浸潤和NF-κB信號通路減輕炎癥反應有一定關系。