劉文嬌 馬 婧 韓瑞鈺 王樹松,

1河北師范大學化學與材料科學學院（河北石家莊 050021）；2．河北省計劃生育科學技術研究院，國家衛(wèi)生和健康委員會計劃生育與優(yōu)生重點實驗室/河北省生殖醫(yī)學重點實驗室（河北石家莊 050071）

鋅是人類機體生長發(fā)育必需的微量元素之一，是人體內300多種酶和轉錄因子的重要組成成分，直接參與核酸和蛋白質的合成、細胞的分化和增殖以及許多重要的代謝，在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，缺鋅導致男（雄）性生育力下降。研究表明，鋅穩(wěn)態(tài)的精確控制對于維持機體健康和預防疾病至關重要，糖尿病患者體內存在鋅穩(wěn)態(tài)失衡[1]。鋅離子的平衡主要由鋅轉運蛋白ZnTs家族和Zips家族兩個家族完成的，前者能將鋅離子由胞質中轉運到胞質外，后者則將鋅離子由胞質外轉運到胞質中[2]。因此，本文觀察了糖尿病雄性大鼠生殖性腺中鋅轉運蛋白的變化，闡明鋅轉運蛋白在糖尿病雄性生殖系統(tǒng)中的作用。

材料與方法

一、實驗方法

（一）動物模型構建及分組

6周齡健康雄性SD大鼠20只，隨機分為對照組和糖尿?。―M）組，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)并于8周后一次性注射0.2mL枸櫞酸鈉緩沖液；DM組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，8周后一次性腹腔注射30mg·kg-1鏈脲佐菌素，1周后以空腹血糖大于11.7mmol/L視為造模成功，于造模后處死并留取性腺組織，性腺組織一半置于10%福爾馬林液中固定，剩余組織立即放入液氮中，然后轉入-80℃冰箱保存待用。實驗動物購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心。

（二）大鼠精子濃度和活力的檢測

取新鮮大鼠左側附睪尾部，置于裝有生理鹽水的EP管中，用眼科剪充分剪碎，37℃孵育10min，使精子充分溢出，取10μl置入精子計數(shù)板中，記錄精子濃度和活力。

（三）HE 染色

大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織在10%福爾馬林中固定24h后，常規(guī)石蠟包埋，切片。常規(guī)脫蠟復水；蘇木素染色6min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化3s，自來水沖洗，0.1%氨水返藍3s，自來水沖洗，伊紅染色8min，自來水沖洗；脫水脫蠟：100%酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，脫蠟劑Ⅰ、Ⅱ各5min，中性樹膠封片。

（四）免疫組織化學

常規(guī)脫蠟復水。PBS洗3次，每次5min。檸檬酸鈉-EDTA抗原修復，室溫自然冷卻，PBS洗3次，每次5min。3%過氧化氫孵育40min，PBS洗3次，每次5min。山羊血清封閉1h。滴加一抗（其中對照用1×PBS，ZnT1和ZnT8以 1：100比例稀釋，Zip1以 1:200的比例稀釋，Zip2以1:400的比例稀釋），4℃過夜。PBS洗滌3次，滴加生物素標記山羊抗兔IgG二抗工作液，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，滴加辣根酶工作液并室溫孵育30min，PBS洗滌3次，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。陽性染色為棕黃色。

（五）實時定量PCR檢測

用RNA提取試劑盒（ZP404，北京莊盟國際）分別提取睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織的總RNA，按照說明書逆轉為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增ZnT1、ZnT8、Zip1和Zip2。PCR反應條件如下：95℃預變性 3min，95℃30s、62℃30s、72℃30s，共35個循環(huán)，在72℃30s處收集熒光信號，72℃延伸5min。分別以正常大鼠組織為1倍目的基因表達量的校準樣品，根據(jù)2-△△ct計算糖尿病組大鼠組織中各目的基因mRNA的相對表達

β-actin 引 物 序 列 ：5′-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3′，5′-GATGCCTCTCTTGCTCTGGG-3′;

ZnT1 引物序列：5′-GCAGAGAAGGCTCCAACA GT-3′,5′-ATTCGGGCTGTTTGTTTGGC-3，;

ZnT8 引物序列：5′-GCACTGATGTAGGACGCA CT-3′，5′-CAGGCTTCTGTCCACGTTCT-3′;

Zip1 引物序列 ：5′-GCCTTGGAGGCTCTTCATGT-3′，5′-AAGCCAGTGTGATCTGCTCC-3′;

Zip2 引 物 序 列 ：5，-CTGCATCCGTCTGGAACCAT-3′，5′-ATGGTTCCAGACGGATGCAG-3′;

（六）Western Blot

稱取性腺組織0.1g，每管加入裂解液500μl。超聲裂解5min。低溫離心取上清，用BCA試劑盒（PQ0012，杭州聯(lián)科生物）測蛋白濃度。凝膠電泳，80V恒壓30min左右，待電泳至濃縮膠底部時，將電壓轉置120V，電泳約60min。恒流200mA電泳轉膜1.5h。5%脫脂奶粉封閉1.5h。一抗孵育（其中ZnT1、ZnT8、Zip1和Zip2以1:1000的比例稀釋，內參β-actin以1:10000的比例稀釋）4℃過夜。用1×TBST溶液膜洗3次，每次10min。二抗（以1:8000的比例稀釋）搖床孵育1.5h。1×TBST洗兩次，1×TBS洗1次，每次洗10min。ECL化學發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析目的條帶的灰度值和內參條帶的灰度值。

二、統(tǒng)計學處理

采用SPSS21.0軟件進行分析，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，符合正態(tài)分布進行t檢驗分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、大鼠一般情況

第9周時，糖尿病組10只大鼠中7只大鼠空腹血糖＞11.7mmol/L，造模成功率為70%。實驗結束時，糖尿病組大鼠體重、空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)，甘油三酯(Triglyceride,TC)，總膽固醇（Total cholesterol,TC），低密度脂蛋白膽固醇 （Low Density Liporotein Cholesterol,LDL-C)均顯著高于對照組，高密度脂蛋白膽固醇 （High Density Lippoorotein Cholesterol,HDL-C）顯著低于對照組，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。糖尿病組大鼠精子濃度和精子活力顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1 實驗結束時兩組大鼠血糖血脂、精子參數(shù)的情況（x±s）

二、兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織的HE染色（見圖1）

睪丸：對照組大鼠睪丸生精小管內的不同種類的細胞有序排列，結構比較完整，有大量精子存在。糖尿病組大鼠睪丸中的生精小管內，有些間質細胞結構發(fā)生破壞，組織中間出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，精子數(shù)量減少。

附睪：對照組大鼠附睪管內均勻分布大量精子，并無規(guī)則地排列著，染色較深，同時組織細胞內的核和胞質清晰可見。糖尿病組大鼠附睪內精子數(shù)量明顯減少，在附睪上皮細胞出現(xiàn)了空泡樣的變化以及部分主細胞的胞核發(fā)生溶解破裂的現(xiàn)象。

精囊：對照組大鼠精囊腺腔內含有嗜伊紅分泌物，腺腔內有許多褶皺。糖尿病大鼠精囊腺腔內褶皺減少。

前列腺：對照組大鼠前列腺為薄上皮、內壁光滑，胞質染色較深并且比較完整。糖尿病組大鼠前列腺內壁褶皺增多，上皮增生，疏松結構發(fā)生改變。

圖1 兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺組織的HE染色（標尺=20μm）

三、免疫組織化學分析鋅轉運蛋白在兩組大鼠性腺組織中的定位和表達（見圖2）

睪丸：在大鼠睪丸中ZnT1在質膜、間質細胞以及生精細胞細胞質內表達，糖尿組明顯低于對照組；ZnT8在睪丸間質細胞和生精細胞胞質中均有表達，糖尿病組明顯高于對照組；Zip1和Zip2在睪丸生精細胞細胞質中表達，糖尿病組明顯低于對照組。

附睪：ZnT1和Zip1表達在附睪腔內細胞質中，糖尿病組高于對照組；ZnT8表達在附睪管內上皮細胞、附睪上皮基底部細胞以及腔內胞質中，糖尿病組高于對照組；Zip2表達在附睪管頂細胞以及腔內胞質中，糖尿病組低于對照組。

精囊：ZnT1、ZnT8、Zip1 和 Zip2 均在大鼠精囊腺上皮細胞的胞漿和胞膜上表達。糖尿病組ZnT1、Zip1表達明顯低于對照組，ZnT8兩組之間表達相反，Zip2在兩組表達相近。

前列腺：ZnT1、ZnT8、Zip1 和 Zip2 在大鼠前列腺中表達在前列腺上皮細胞的胞漿與胞膜中，糖尿病組較對照組表達均稍高。

圖2 免疫組織化學法檢測ZnT1、ZnT8、Zip1、Zip2在兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺組織中的表達（標尺=20μm）

四、Western blot檢測鋅轉運蛋白在兩組大鼠性腺組織中的蛋白水平表達（見圖3）

圖3 兩組大鼠性腺組織Znt1、Znt8和Zip1和Zip2蛋白表達情況

ZnT1：在糖尿病組睪丸和精囊中表達水平明顯低于對照組 （P<0.05），在附睪中表達顯著高于對照組（P<0.05）。

ZnT8：在糖尿病組睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中均高于對照組（P<0.05）。

Zip1：在糖尿病組睪丸和精囊組織中低于對照組（P<0.05），在附睪中表達顯著高于對照組（P<0.05），在前列腺中未見明顯差異（P>0.05）。

Zip2：在糖尿病組附睪中明顯低于對照組（P<0.05），其它組織中未見明顯差異。

五、RT-PCR分析鋅轉運蛋白在兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織中mRNA表達（見圖4）

圖4 兩組大鼠性腺組織Znt1、Znt8和Zip1和Zip2 mRNA的表達

ZnT1：糖尿病組大鼠睪丸、精囊中ZnT1 mRNA的表達較對照組下降，在附睪、前列腺中升高，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

ZnT8：糖尿病組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺中ZnT8 mRNA的表達較對照組增加，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

Zip1：糖尿病組大鼠睪丸和精囊中Zip1 mRNA的表達較對照組明顯降低（P<0.05），附睪和前列腺中表達較對照組明顯升高（P<0.05）。

Zip2：糖尿病組大鼠附睪Zip2 mRNA的表達較對照組明顯降低（P<0.05），前列腺組織明顯升高（P<0.05）。

表2 兩組大鼠性腺組織Znt1、Znt8和Zip1和Zip2蛋白和mRNA表達變化趨勢匯總（與對照組相比，P<0.05）

討 論

鋅是人類必需的微量元素之一，鋅與人體內近300種酶的活性有關，廣泛參與核酸和蛋白質的代謝，因此也影響到各種細胞的生長、分裂和分化。缺鋅可產生多種疾病。糖尿病是由環(huán)境因素、遺傳因素共同作用引起的、以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，低鋅血癥是糖尿病患者的普遍癥狀[3]。鋅離子的穩(wěn)態(tài)是由鋅轉運蛋白精密調控，鋅轉運體的正常分布對睪丸組織的保護起著重要作用，保證了鋅在各種細胞中的合理分配，使鋅發(fā)揮其正常的生理功能[4]。鋅轉運蛋白的表達改變不僅可能干擾細胞器中鋅的穩(wěn)態(tài)，還可能導致細胞器功能障礙，鋅穩(wěn)態(tài)失衡涉及人類疾病的發(fā)病機理[5,6]。

ZnT1是ZnT家族中最先被發(fā)現(xiàn)的鋅轉運體，是一種細胞膜蛋白，它能夠將Zn2+從細胞漿中轉運到細胞外，降低細胞漿內Zn2+的濃度，從而維持細胞內適宜的鋅水平[7,8]。ZnT1還具有抑制鋅通過L型鈣通道內流的功能。Elgazar等[9]發(fā)現(xiàn)ZnT1存在于質膜中，同時存在于支持細胞的細胞質中。本研究顯示，ZnT1在大鼠睪丸、精囊、附睪和前列腺組織中均有表達，糖尿病組大鼠睪丸和精囊中表達明顯降低，附睪中表達明顯增高。

ZnT8是ZnT家族的一個成員，ZnT8是一種特異存在于胰島β細胞的鋅轉運體，其功能為向胰島β細胞的胰島素分泌小泡內轉運鋅離子，對于胰島素的貯存和分泌十分重要?；A研究表明ZnT8能刺激胰島素分泌，造成電壓敏感性鈣離子通道開放，導致鈣離子流出和鈣離子含量增加[10]。研究證實ZnT8在睪丸組織中也有表達，其功能可能與睪酮合成有關[11]。Zhang等[12]研究表明ZnT8存在于人和小鼠的睪丸間質細胞中，ZnT8基因敲除的小鼠血清睪酮水平遠低于正常小鼠，表明ZnT8在睪酮生物合成中起到關鍵作用，還證實ZnT8通過影響蛋白激酶A（PKA）信號通路進而影響線粒體中的鋅含量。本研究發(fā)現(xiàn)ZnT8蛋白和ZnT8 mRNA在大鼠睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中均有表達，糖尿病組大鼠睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中ZnT8表達均明顯升高。結果說明，糖尿病對雄性大鼠各性腺及附性腺組織中ZnT8的影響是相同的，促進Zn2+從細胞漿中轉運到細胞外，降低細胞漿內Zn2+的濃度。

鋅鐵轉運蛋白ZIP家族(SLC39)是一類介導鋅攝入的跨膜蛋白,目前已在人體中發(fā)現(xiàn)14個成員(ZIP1～14)。ZIP1和Zip2位于細胞膜，當細胞漿游離鋅缺乏時，ZIP1、Zip2從細胞外轉運鋅離子進入細胞漿，以維持細胞的鋅穩(wěn)態(tài)。有研究表明Zip1和Zip2在相同的細胞類型中共存，它們之間還能相互作用形成異質多聚體[13]。Franz等[14]認為Zip2是一種促進的二價金屬離子轉運蛋白，可以通過細胞外pH和膜電位調節(jié)，并且H+介導的調節(jié)機制可能對確定運輸速度和方向具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Zip1和Zip2在雄性大鼠性腺組織中均有表達；糖尿病大鼠Zip1和Zip2 mRNA在前列腺組織中均顯著升高，Zip1mRNA、Zip1蛋白在糖尿病大鼠睪丸和精囊組織中呈現(xiàn)下調，在附睪中表達上調；Zip2 mRNA、Zip2蛋白在糖尿病大鼠附睪組織中呈現(xiàn)下調，Zip2蛋白在精囊中上調、Zip2 mRNA在糖尿病大鼠前列腺組織中呈現(xiàn)上調。

Foster等[15]研究認為鋅轉運蛋白mRNA的相對表達 變 化 很 大 ，ZnT1、Zip1 表 達 最 豐 富 ，ZnT1 和Zip1mRNA彼此呈高度正相關關系，其在跨越質膜的鋅轉運中具有相互作用。本研究結果顯示，ZnT1和Zip1mRNA和蛋白表達在雄性性腺組織中變化趨勢也具有一致性，ZnT1和Zip1之間的相關性表明這兩種鋅轉運蛋白具有高度協(xié)調作用。

綜上所述，在雄性大鼠生殖性腺中ZnT1、ZnT8和Zip1、Zip2mRNA和蛋白都均有表達，這4個抗體的免疫組織化學也都具表達。ZnT1、ZnT8和Zip1、Zip2在糖尿病大鼠性腺中表達發(fā)生了變化，反映了組織內鋅穩(wěn)態(tài)的失衡，鋅代謝紊亂對雄性大鼠生育力受損起到重要的作用。