王德信 石浩 王少祥 羅偉沼 魏玉鍵 李浩 楊曉瑩 梁宏玲

【摘要】以姬秋麗的葉片和莖尖為外植體材料，進行多肉植物組培快繁技術(shù)研究。研究結(jié)果表明：以莖尖為外植體培養(yǎng)效果最佳，先用75%乙醇處理30s，再用0.1%升汞浸泡12 - 15min為最佳消毒處理方法;以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、NAA、KT等植物生長調(diào)節(jié)劑，適宜誘導姬秋麗愈傷組織及叢生芽的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.Omg/L，效果明顯;叢生芽增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2mg/L+KT l.Omg/L+NAA 0.2mg/L最為適宜;生根培養(yǎng)基以1/2MS+IBA 2.0mg/L為最佳，試驗證明最終成苗率可達90%以上，根部粗壯生長狀態(tài)良好，研究表明姬秋麗組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系增殖數(shù)高，易成活，質(zhì)量高。

【關(guān)鍵詞】姬秋麗;組織培養(yǎng);快繁體系

【中圖分類號】S682.33

【文獻標識碼】A

姬秋麗（ Graptopetalum mendazoe）是景天科風車草屬多肉植物，姬秋麗是一種雜交的品種，名字是由日本傳過來的。姬秋麗為迷你型多肉植株，植株叢生，多分枝，呈蓮座葉盤狀。葉子橢圓形，葉片較小，一般小于2cm，葉上分布著或多或少的細微紅點。單株直徑3cm左右，葉子顏色呈綠色或黃綠色，但強光環(huán)境下呈紅色或橘紅色，姬秋麗春季開花，花小巧玲瓏。枝莖比較短，看上去比較緊湊。

姬秋麗具有非常高的觀賞價值，是近幾年在國內(nèi)多肉市場流行的品種之一，但是姬秋麗生產(chǎn)主要由葉插繁殖并且繁殖速度慢，生產(chǎn)周期慢，而且病毒不斷積累，進而影響品質(zhì)，嚴重影響姬秋麗的口碑。本研究主要通過對6-BA、NAA、KT、IBA等植物生長調(diào)節(jié)劑適合濃度篩選探索姬秋麗叢生芽誘導、增殖、生根繁殖等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響因素，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖生產(chǎn)多肉植物，提高多肉植物的品質(zhì)和產(chǎn)量，增加收入。本研究通過對多肉植物姬秋麗組織培養(yǎng)體系的探索，為姬秋麗快速繁殖提供組培技術(shù)，同時加快姬秋麗的工廠化生產(chǎn)進程。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

以生長狀況良好的姬秋麗為研究材料，選取生長狀況良好的葉片和莖尖為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理。（1）將姬秋麗葉片用自來水沖洗干凈，用紗布分別將姬秋麗葉片和莖尖包裹住，將紗布綁定在水龍頭上，固定好，打開水龍頭沖洗20 - 30min，調(diào)整位置保證沖洗均勻。

（2）沖洗完后，從水龍頭取下紗布，取準備好的表面洗滌劑（洗衣粉或者洗潔精）適量放入lOOOml燒杯中，加自來水用玻璃棒攪拌混勻，混勻后將紗布中的姬秋麗葉片和莖尖輕輕放人燒杯。玻璃棒攪拌后，靜置30min充分去污。

（3）取出姬秋麗葉片和莖尖，用紗布清洗葉片和莖尖表面，清洗的過程中一定要全面，細細輕柔搓洗，洗凈之后再用自來水沖洗姬秋麗葉片和莖尖20 - 30min。

（4）取出外植體材料用75%的酒精浸泡30 - 60s。

（5）倒人0.1%的升汞（HgC12）浸泡10 - 15min。

（6）無菌水沖洗4-5次。

1.2.2無菌室及超凈臺滅菌。先對無菌室進行滅菌，然后用酒精棉球擦拭超凈臺，打開超凈臺紫外線燈，預先20min，殺菌消毒，打開排氣扇，防止細菌進入，保持一個無菌的環(huán)境。

1.2.3 無菌操作。將處理的姬秋麗葉片、莖和莖尖放人超凈工作臺內(nèi)，先用濃度為75%的酒精滅菌30 - 60s，要輕微震蕩切勿搖出。再用無菌水沖洗2-3次，每次10s - 20s，然后用0.1%升汞（ HgC12）滲透內(nèi)部滅菌，輕輕搖晃10in，最后用無菌水沖洗3-5次。滅菌后的葉片切成0.5cm×0.5cm的方塊，莖和莖尖切成0.5cm莖段，分別接種于預先滅菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)條件

試驗在NLS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加6g/L的瓊脂和30g/L的蔗糖，pH值調(diào)節(jié)至5.8 - 6.0，121℃高壓滅菌鍋中滅菌20min，常溫后添加激素（激素已抽濾滅菌）備用。培養(yǎng)室溫度控制在25℃，光照強度20001x，光周期為16h光照，6h黑暗。

1.4誘導培養(yǎng)

在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的6-BA、NAA和KT激素，設(shè)置三種激素水平（見表1），利用不同外植體和最合適滅菌方法，將外植體接種于各種培養(yǎng)基上，采用L。（ 34）正交試驗設(shè)計（見表2），每種處理接種5瓶，每瓶接種4個外植體，3次生物學重復，30 - 45d統(tǒng)計誘導情況。

1.5 增殖培養(yǎng)

在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的6-BA、NAA和KT激素，設(shè)置不同激素水平（見表3），將初代培養(yǎng)中誘導得到的叢生芽或愈傷組織接種于以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加不同含量NAA、6- BA、KT的培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，采用k（ 34）正交試驗設(shè)計（見表4），每個處理5瓶，每瓶接種1株，重復3次，30d后統(tǒng)計增殖情況。

1.6生根培養(yǎng)與移栽

無菌條件下，將增殖后的叢生芽分離出單芽，分別接種于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基以1/2MS作為基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加不同濃度的IBA（1、2、3mg/L），同時添加15g/L的活性炭，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計組培苗的成長情況。當植株長至約4cm時進行煉苗移裁，以泥炭、蛭石、珍珠巖復配材料為煉苗基質(zhì)，按照3：1：1比例混勻，121℃高壓蒸汽滅菌消毒后使用。打開瓶口煉苗，10d后用鑷子將小苗取出，清除附著在根部的培養(yǎng)基，移栽于基質(zhì)中，30d后統(tǒng)計組培苗的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌條件的篩選

試驗中分別用75%酒精、2%次氯酸鈉及0.1%升汞分別對姬秋麗多肉植物的不同外植體進行滅菌時間條件摸索（見表5），結(jié)果表明：利用75%酒精和2%次氯酸鈉滅菌材料，無論是葉片還是莖，污染率較高，最高的可以達到96.3%，最低污染率67%。說明Naao不適合多肉植物姬秋麗外植體的的滅菌。然而利用75%酒精和1%升汞滅菌材料，污染率較低，最低的僅有6.7%，說明多肉植物組培中，外植體滅菌選用75%酒精和o.1%升汞滅菌最為適合;研究還表明隨著HgC12滅菌時間延長，污染率逐步下降，使用HgCI2對最外植體表面進行消毒，滅菌效果更好。葉片消毒時間不宜過長，一般不超過15min為宜，時間過長，會導致后續(xù)培養(yǎng)生長緩慢，時間太短，污染率偏高。

2.2 愈傷組織及叢生芽分化誘導分析

不同激素配比的培養(yǎng)基均能成功誘導姬秋麗形成愈傷組織（見表6），誘導率最高可達到85%，大多數(shù)能夠誘導分化出叢生芽，少部分愈傷組織繼代培養(yǎng)之后褐化死亡。以姬秋麗的葉為外植體，當培養(yǎng)基為MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）時，誘導形成叢生芽的誘導率為76.7%，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，呈淡黃綠色，叢生芽數(shù)量多，整齊度高。研究結(jié)果表明適宜誘導姬秋麗愈傷組織及叢生芽的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

2.3 不同激素濃度配比對叢生芽增殖的影響

通過誘導長出叢生芽之后就轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，叢生芽增殖結(jié)果見表7。結(jié)果表明，叢生芽增殖培養(yǎng)的9種激素配比培養(yǎng)基均有較理想的增殖效果，增殖系數(shù)集中在5-9之間，隨著6-BA濃度增加，增殖效果也稍好。其中MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 1.0 mg/L取得最佳增殖培養(yǎng)效果，在培養(yǎng)30d以后，大部分叢生芽的基部均可連續(xù)分化出5 - 10個單芽，經(jīng)過45d之后，即可呈現(xiàn)出團簇狀叢生，而后叢生芽逐漸變?yōu)樯罹G色。

2.4 不同IBA濃度對生根的影響

待姬秋麗無菌培養(yǎng)長出增殖叢生芽之后，分離出單芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，在1/2MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加3種不同濃度的IBA及1.5g/L的活性炭，結(jié)果表明：1/2MS+IBA 2.0mg/L+活性炭1.5g/L的培養(yǎng)條件最為適宜，生根數(shù)量多，效果好，IBA植物生長調(diào)節(jié)劑對于姬秋麗生根誘導有促進作用。

3 討論

多肉植物繁殖速度慢，利用組培快繁技術(shù)能夠快速獲得大量組培苗。多肉植物由于肉質(zhì)多汁液，外植體的消毒需要徹底，否則污染率較高，本實驗結(jié)果中利用洗衣粉浸泡30min后用75%乙醇和0.1%升汞配合消毒技術(shù)，取得較好結(jié)果，污染率控制在7%左右。在虹之玉、姬朧月、玉露、佛手等多種多肉植物外植體滅菌中進行了嘗試，均取得了良好的效果，證明該方法非常有效。

外植體選擇上，發(fā)現(xiàn)莖尖誘導率明顯高于莖和葉片，而且多數(shù)莖尖誘導不經(jīng)過愈傷組織即可生長出芽和苗，成苗率好，相對葉片和莖誘導率高，有的葉片誘導愈傷組織時能夠很快誘導生根。

本系統(tǒng)中篩選出來的愈傷組織及叢生芽誘導培養(yǎng)基，在虹之玉、姬朧月、玉露、佛手等多肉植物快繁中進行試驗，發(fā)現(xiàn)在虹之玉和姬朧月組培中取得較好效果，但是需要培養(yǎng)基中的激素濃度微調(diào)，玉露、佛手等多肉植物中效果不理想，說明不同多肉植物組培條件不完全一致，需要根據(jù)多肉植物自身特點，采用不同增殖方法。本研究初步建立了姬秋麗等多肉植物的組織培養(yǎng)的最佳外植體及各培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基配方，結(jié)果表明愈傷組織具有高誘導率及成苗率，為姬秋麗的工廠化育苗提供了技術(shù)支撐。

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[作者簡介]王德信（1975-），男，山東聊城人，博士，副教授，研究方向：組織培養(yǎng)技術(shù)，植物基因表達調(diào)控及功能。