郭 敏，李寒妹，王瑞寧，鄭曉寧，劉錚鑄，彭永東，鞏元芳*，李祥龍*

(1.河北科技師范學院 動物科技學院 河北省特色動物種質資源挖掘與創(chuàng)新重點實驗室，河北 秦皇島 066004；2.河北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071000)

狐皮，因其色澤艷麗、絨毛稠密豐厚、御寒力強，極具經(jīng)濟價值。毛色是影響狐皮經(jīng)濟價值的一個重要因素，其形成是一個復雜的生理生化過程，與黑色素的合成和分布有關。黑色素的生成受多種基因調控，MITF-M是調控動物毛色形成信號下游通路中的一個重要功能基因，可調控多種其他黑色素基因的轉錄(如：AIM、MART1/MLANA、SILV/PMEL17、TRPM1和TYR家族等)[1]，引起動物毛色的多樣化。

MITF具有一個bHLHZip(螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈)結構，可識別靶基因啟動子區(qū)E-box和M-box，進而啟動下游基因的轉錄[2]。該基因至少存在9種不同啟動子結構，調控編碼多種蛋白質異構體[3]，其中MITF-M基因在黑素細胞和黑素瘤細胞中特異表達[4]。楊玉靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊MITF-M過表達會使黑素細胞TYR和TYRP-1的表達量增加，揭示黑素細胞中TYR和TYRP-1的表達可能受MITF-M基因的調控。鄭嫩珠等[6]發(fā)現(xiàn)MITF-M和TYR mRNA在各組織間的表達量與黑色素含量呈顯著正相關。此外，張建一等[7]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛MITF-M基因mRNA在心臟、腎臟和皮膚等眾多組織中，僅在皮膚中特異性表達，且在黑色被毛皮膚中的表達量顯著高于白色被毛皮膚(P<0.01)。以上研究提示MITF-M基因與動物被毛顏色關系密切。

眾所周知，啟動子是基因表達的指揮棒[8]，啟動子的順式作用元件和反式作用因子對基因的轉錄調控起重要作用。目前，MITF-M基因作為調控狐貍毛色形成的相關研究鮮見報道，因此，研究北極狐MITF-M基因啟動子活性及其相關轉錄調控元件，可為進一步深入探究該基因調控狐貍毛色的遺傳機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑北極狐組織樣品來自河北省秦皇島市昌黎縣金島育種場；LA Taq DNA Polymerase、pMD19-T Vector、DH5α感受態(tài)細胞、反轉錄試劑盒、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix、TransStart Taq DNA Polymerase購自北京全式金公司；DNA膠回收試劑盒、質粒DNA小量提取抽提試劑盒、無內毒素質粒DNA大量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；DPBSD、MEM培養(yǎng)基(高糖型)購自Hyclone公司；限制性內切酶Kpn Ⅰ和Mlu Ⅰ、0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM培養(yǎng)基Lipofectamine?2000Transfection Reagent(Lip2000脂質體)、胎牛血清購自Thermo Fisher Science公司；質粒載體pGL3-Basic、pRL-TK、人腎上皮細胞系(293T)、人惡性黑色素瘤細胞系(A375)均由本實驗室保存。

1.2 北極狐MITF-M基因核心啟動子區(qū)的確定

1.2.1啟動子的克隆及序列分析 參照文獻[9]所得北極狐MITF-M基因核苷酸序列以及該基因啟動子區(qū)和調控元件的預測結果，在編碼區(qū)上游設計擴增6個缺失片段的引物(表1,圖1)。通過NEB cutter?(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)在線分析限制性內切酶位點，片段2 279 F、1 738 F、1 313 F、1 040 F、524 F和236 F上游引物引入酶切位點KpnⅠ(GGTACC)及保護堿基GG，下游引物引入酶切位點MluⅠ(ACGCGT)及保護堿基CC。

圖1 北極狐MITF-M基因啟動子缺失片段示意圖

PCR擴增體系為50 μL：基因組DNA 1 μL，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L)8 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，LA Taq DNA聚合酶(5 U/ μL)0.5 μL，滅菌ddH2O 33.5 μL。

PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)(退火溫度和延伸時間見表1)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 MITF-M基因啟動子區(qū)缺失片段和轉錄因子結合位點引物

1.2.2缺失片段載體構建及鑒定 將缺失片段X 的PCR產(chǎn)物克隆至載體pMD19-T中，再將重組載體(pMD19-X)轉化至DH5α感受態(tài)細胞，鑒定為陽性的菌液PCR樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。對重組克隆載體pMD19-X及pGL3-Baisc載體同時進行雙酶切，將回收產(chǎn)物進行連接構建pGL3-Baisc-X重組表達載體并轉化至DH5α感受態(tài)細胞，通過菌液PCR、測序和雙酶切3種方法依次鑒定重組載體，對陽性重組載體進行無內毒素質粒的提取。

1.2.3突變載體的構建及鑒定 以pGL3-Basic-524質粒為模板，分別以引物524F和Mut-CREB-1-Rm、Mut-CREB-1-Fm和R、524F和Mut-Sp1-2-Rm、Mut-Sp1-2-Fm和R、524F和Mut-Sp1-3-Rm、Mut-Sp1-3-Fm和R(表1)通過重疊延伸PCR技術擴增上、下游引物。重疊延伸PCR擴增體系為40 μL：野生型質粒模板2 μL，2×TransStart FastPfu Super Mix 20 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O 16 μL。將擴增產(chǎn)物切膠回收并等比例混合，用此混合物為模板，以引物524F和R擴增突變載體全長片段。PCR擴增體系為50 μL：混合物模板2.5 μL，10×TransStart Taq Buffer 5 μL，TransStart Taq DNA Polymerase 0.5 μL，dNTP Mix(10 mmol/L)1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O 39 μL。重疊延伸和全長片段PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，退火30 s，72℃延伸共35個循環(huán)(退火溫度和延伸時間見表1)；72℃最終延伸10 min，4℃保存。通過菌液PCR和測序鑒定突變載體，并提取無內毒素質粒。

1.2.4細胞的培養(yǎng)和轉染 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T和A375細胞。轉染前將細胞接種于24孔板內，待細胞貼壁生長覆蓋率至70%～80%時，分別將重組報告基因質粒pGL3-Baisc-X(293T：0.95 μg；A375：0.9 μg)、內參質粒pRL-TK(293T：0.05 μg；A375：0.1 μg)和lip2000脂質體2.0 μL加入至50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中得到質粒-脂質體混合物，然后轉染到細胞，培養(yǎng)48 h后收集細胞。生物學重復至少3次，每次3個技術重復。

1.2.5雙熒光素酶活性鑒定 根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進行啟動子活性檢測，用DPBS洗細胞2次，每孔加入150 μL細胞裂解液，振蕩30 min 至細胞完全裂解，向1.5 mL EP管中添加10 μL 裂解好的細胞待測樣品和20 μL LAR Ⅱ試劑，通過發(fā)光儀檢測pGL3質粒中螢火蟲熒光素酶活性，檢測10 s時的化學發(fā)光值，讀值為F，隨后加入20 μL Stop&Glo試劑，混勻后檢測pRL-TK質粒中海腎熒光素酶活性，同樣檢測10 s時的化學發(fā)光值，讀值為R。啟動子相對活性值=F/R，即螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.6統(tǒng)計分析 所有樣品在轉染293T和A375細胞株時進行至少3次生物學試驗重復，將試驗所得活性值數(shù)據(jù)標準化并利用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，不同檢測片段的啟動子活性數(shù)據(jù)用單因素ANOVA進行分析(LSD和Duncan法)，P<0.05 表示差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

1.3 核心啟動子區(qū)轉錄因子結合位點的預測分析通過在線軟件WWW Signal SCAN、Cluster、Nsite、JASPAR和AliBaba 2.1等預測北極狐MITF-M基因核心啟動子區(qū)的轉錄因子結合位點，詳細情況見表2。

表2 轉錄因子結合位點預測軟件

1.4 核心啟動子區(qū)轉錄因子結合位點突變體活性分析將轉錄因子結合位點突變載體轉染至A375和293T細胞，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結果與野生型對比分析轉錄因子結合位點突變前后啟動子活性的變化。

2 結果

2.1 北極狐MITF-M基因啟動子缺失片段的擴增以北極狐基因組DNA為模板，利用所設計引物對MITF-M基因啟動子區(qū)進行缺失片段的擴增，擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，與預期片段大小(2 279，1 738，1 313，1 040，524和236 bp)基本一致(圖2)。隨后將擴增所得各缺失片段連接到pMD19-T載體上。

圖2 北極狐MITF-M基因啟動子區(qū)缺失片段PCR擴增結果 M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL5000 DNA Marker;1～6.引物為2279F、1738F、1313F、1040F、524F和236F的擴增產(chǎn)物

2.2 北極狐MITF-M基因啟動子熒光素酶表達載體的構建使用T4DNA連接酶對雙酶切后回收的片段X和雙酶切后pGL3-Basic質粒進行連接(pGL3-basic-X)，將構建的MITF-M基因啟動子熒光素酶表達載體進行菌液PCR(圖3)、雙酶切鑒定(圖4)和測序，對其依次進行鑒定，結果與預期基本一致，表明北極狐MITF-M基因重組表達載體pGL3-basic-X構建成功。

圖3 北極狐MITF-M基因重組表達載體pGL3-basic-X菌液PCR擴增結果 M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL5000 DNA Marker;1～6.引物為2279F、1738F、1313F、1040F、524F和236F重組表達載體pGL3-basic-X菌液PCR的擴增產(chǎn)物

圖4 北極狐MITF-M基因重組表達載體pGL3-basic-X雙酶切鑒定結果 M1.DL5000 DNA Marker;M2.DL10000 DNA Marker;1～6.分別為重組表達載體pGL3-basic-X雙酶切鑒定產(chǎn)物

2.3 北極狐MITF-M基因5′端調控序列的活性分析利用啟動子雙熒光素酶報告基因表達載體(pGL3-Basic-X)無內毒素質粒轉染細胞(A375和293T)，測定MITF-M基因雙熒光素酶活性(圖5)。結果顯示，6個啟動子報告基因無內毒素質粒轉染2種細胞的活性值高低趨勢一致，A375細胞活性值均低于293T細胞；293T細胞轉染結果顯示6個啟動子報告基因的活性與pGL3-basic對照組比較均差異極顯著(P<0.01)；A375細胞轉染結果表明除片段1 040 bp(-1 026 bp/+13 bp)和236 bp(-222 bp/+13 bp)啟動子活性與pGL3-basic對照組比較無顯著性差異外(P>0.05)，2 279 bp(-2 265 bp/+13 bp),1 738 bp(-1 724 bp/+13 bp),1 313 bp(-1 299 bp/+13 bp)和524 bp(-510 bp/+13 bp)4個報告基因活性值與pGL3-basic對照組相比均呈極顯著性差異(P<0.01)?？v觀全圖發(fā)現(xiàn)片段524 bp(-510 bp/+13 bp)區(qū)域在2種細胞間的活性值均最高，且與其他5個片段活性相比，均呈極顯著性差異(P<0.01)，提示此處MITF-M基因的啟動表達作用最強。當啟動子片段縮短至236 bp(-222 bp/+13 bp)時，熒光素酶相對活性值明顯下降，推測-510 bp/-222 bp可能是北極狐MITF-M基因的核心啟動子區(qū)。

圖5 北極狐MITF-M基因啟動子表達載體轉染細胞的相對熒光素酶活性值 注：大小寫字母分別表示在P=0.01和P=0.05 水平的顯著性

2.4 北極狐MITF-M基因核心啟動子區(qū)轉錄因子結合位點的生物信息學分析通過在線軟件WWW Signal SCAN、Cluster等數(shù)據(jù)庫對MITF-M基因核心啟動子區(qū)(-510 bp/-222 bp)的轉錄因子結合位點進行了預測(表3)，為避免出現(xiàn)假陽性，取至少3個軟件的預測結果。由表3可知，該區(qū)域可能存在CREB(-312 bp/-319 bp)，Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)3個轉錄因子結合位點。

表3 轉錄因子結合位點預測結果

2.5 北極狐MITF-M基因核心啟動子區(qū)轉錄因子結合位點突變體活性分析圖6是以pGL3-524為模板預測得到的3個轉錄因子結合位點CREB(-312 bp/-319 bp)，Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)點突變圖，以此構建了突變體(圖7)，突變前后序列情況見表4，分別轉染至A375和293T細胞，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結果(圖8)表明，-312 bp/-319 bp，-295 bp/-307 bp和-249 bp/-262 bp位置CREB、Sp1和Sp1轉錄結合位點的活性與野生型524 bp(-510 bp/+13 bp)均呈極顯著性差異(P<0.01)，表明以上3個區(qū)域的突變使北極狐MITF-M基因的啟動子活性上升。

表4 MITF-M基因轉錄因子結合位點突變前后的序列情況

圖6 北極狐MITF-M基因啟動子區(qū)轉錄因子結合位點突變圖 注：■表示轉錄因子結合位點；表示突變

圖7 北極狐MITF-M基因啟動子突變體的克隆 M.DL2000 DNA Marker;1,2.mut-CREB-1上、下游片段;3,4.mut-Sp1-2上、下游片段;5,6.mut-Sp1-3上、下游片段;7～9.mut-Sp1-1、mut-Sp1-2和mut-Sp1-3全長片段

圖8 北極狐MITF-M基因突變啟動子表達載體轉染細胞的相對熒光素酶活性值 注：大小寫字母分別表示在P=0.01和P=0.05水平的顯著性

3 討論

MITF-M基因對于動物的毛色形成是必不可少的[10]，狐皮的毛色作為重要的質量性狀直接影響其品質及價格[11]。因此，MITF-M基因啟動子及其轉錄調控機制的研究對于揭示北極狐被毛顏色的分子遺傳機制具有十分重要的意義。啟動子的克隆方式大致分為基因組文庫篩選法、利用啟動子探針載體篩選啟動子和基于PCR技術克隆啟動子法等，這些技術都已得到廣泛的應用[12]。相關研究顯示，克隆片段若僅含有TSS上游區(qū)域易出現(xiàn)假陰性結果，但選擇包含TSS、ATG及部分CDS區(qū)可提高陽性率[13]。

本試驗利用PCR和熒光素酶報告基因技術等確定了北極狐MITF-M基因的核心啟動子區(qū)在-510 bp/-222 bp區(qū)間，結果與POINDEXTER等[14]的研究結果基本一致。

真核動物功能基因啟動子中多種順式作用元件如CAAT框(GGCTCAATCT)、TATA框(TAT-AATAAT)和GC框(GTGGGCGGGGCAAT)等參與基因的轉錄。GC框主要分布在轉錄起始位點前-128 bp/-23 bp區(qū)域內，一般位于CAAT框的兩側和TATA框上游，能夠結合調節(jié)特異性蛋白Sp1[15]，Sp1已被證實是一種能影響轉錄起始的反式激活子[16]。郭敏等[9]發(fā)現(xiàn)北極狐MITF-M基因啟動子區(qū)-302 bp處存在GC框，本試驗進一步確認該區(qū)域-295 bp/-307 bp和-249 bp/-262 bp位置各存在1個Sp1轉錄因子結合位點，提示GC框(-302 bp)可能與Sp1(-295 bp/-307 bp)蛋白結合調控北極狐MITF-M基因的轉錄。通過對這2個Sp1轉錄因子結合位點進行突變處理，發(fā)現(xiàn)北極狐MITF-M基因啟動子的活性顯著性上升，推測Sp1對北極狐MITF-M基因的轉錄激活起一定調控作用。柳云霞等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Sp1抑制小鼠MEPE基因的轉錄活性，且抑制MEPE基因的表達水平。而田宏攀[18]在研究乳腺癌中DNA甲基化對SP1調控FOXF2轉錄時，發(fā)現(xiàn)SP1可以增強FOXF2啟動子的轉錄活性，SP1轉錄可促進FOXF2啟動子低甲基化的乳腺癌細胞中FOXF2的表達，但DNA甲基化后SP1可抑制FOXF2啟動子的轉錄活性。綜合柳云霞等[17]和田宏攀[18]的研究結果，推測本試驗的2個Sp1轉錄因子結合位點可能對北極狐MITF-M基因的轉錄激活起負調控作用；也可能是2個Sp1轉錄因子結合位點對北極狐MITF-M基因的轉錄激活起正調控作用，只是由于DNA發(fā)生甲基化，抑制了其轉錄激活MITF-M啟動子的活性，但當甲基化的Sp1被點突變后，抑制作用被破壞，使得其對北極狐MITF-M基因轉錄激活的正調控作用發(fā)揮出來，啟動子活性上升。

有研究指出，轉錄因子結合位點CREB和CRE結合能提高下游基因的轉錄活性，部分基因轉錄水平可提高20倍，但若CRE缺失則會導致轉錄活性下降[19-20]。本試驗在北極狐MITF-M基因的核心啟動子區(qū)域內(-312 bp/-319 bp)篩查到CREB，前期研究在-317 bp和-310 bp處分別篩查到CRE[9]，提示CREB(-312 bp/-319 bp)可能與CREs(-317 bp，-310 bp)結合調控北極狐MITF-M基因的轉錄。對轉錄因子結合位點CREB(-312 bp/-319 bp)點突變處理后，北極狐MITF-M基因啟動子的活性顯著性上升。肖慧[21]研究發(fā)現(xiàn)，CREB可通過結合在TNFAIP1基因近端啟動子上的CREs位點負調控TNFAIP1基因的表達，CREs元件缺失突變后對TNFAIP1基因啟動子活性的抑制作用減弱。湯必奎[22]研究發(fā)現(xiàn)IL-6基因啟動子區(qū)域DNA甲基化程度影響CREB和IL-6的結合，DNA甲基化水平低時，二者結合能力增強，CREB和基因活性相關；DNA甲基化水平高時，二者結合能力減弱，CREB和基因沉默相關。綜上，推測本試驗的CREB可能和CREs結合對北極狐MITF-M基因的轉錄激活起負調控作用。但也可能是CREB和CREs結合對北極狐MITF-M基因的轉錄激活起正調控作用。當北極狐MITF-M基因啟動子區(qū)域DNA甲基化時抑制了CREB轉錄激活MITF-M啟動子的活性，但當甲基化的CREB被點突變后，破壞了這種抑制作用，增強了CREB和MITF-M的結合，MITF-M啟動子活性顯著上升。為了確證CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)對北極狐MITF-M基因轉錄調控的具體功能，后期需對以上3個轉錄因子結合位點進行DNA甲基化檢驗，進而用CHIP和EMSA等手段進一步分析驗證。

本試驗成功構建了北極狐MITF-M基因啟動子區(qū)不同長度缺失片段熒光素酶表達載體，確定了-510 bp/-222 bp區(qū)是北極狐MITF-M基因的核心啟動子區(qū)，該區(qū)域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)3個轉錄因子結合位點，它們被點突變后，能使北極狐MITF-M基因的啟動子活性上升，說明這3個轉錄因子結合位點對北極狐MITF-M基因的轉錄激活起到一定的調控作用。