王玉潔，劉 佳，魏 慶，劉佳婷，茹 盟，彭 剛，曾慶節(jié)，謝賢華，殷 超，黃建珍，梁海平

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome,FLHS)是高產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)中常見的一種以大量脂肪異常蓄積且肝臟腫大、出血為主要癥狀的脂肪代謝紊亂疾病。該病主要臨床表現(xiàn)為肥胖和產(chǎn)蛋量下降，剖檢可發(fā)現(xiàn)腹壁、皮下脂肪增多增厚，肝臟甚至心臟有大量脂肪覆蓋，肝臟明顯腫大，體積達(dá)正常的2～4倍，顏色呈淡黃色、土黃色；肝臟有一處或多處出血點(diǎn)[1-2]。

FLHS產(chǎn)生的主要原因除遺傳因素外，還與飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境等因素有關(guān)。另外，自身雌激素分泌量超過(guò)性成熟所需量也容易使雞患FLHS，但主要還是由于營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、能量蛋白比值過(guò)大造成的[3]。雞的肝臟是胴體脂肪合成的主要場(chǎng)所，胴體脂肪90%在此合成[4-5]。能量蛋白比值過(guò)大會(huì)加速乙酰輔酶A向脂肪轉(zhuǎn)化，這使得脂肪在肝臟內(nèi)大量合成；另一方面可能由于日糧中過(guò)少的蛋白質(zhì)引起載脂蛋白合成不足，減少了肝臟對(duì)脂肪的運(yùn)出，使其在肝臟異常蓄積，導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重脂肪變性，最終導(dǎo)致FLHS的發(fā)生[6]。

李秀鈞等[7]研究顯示，脂肪組織通過(guò)分泌多種激素信號(hào)調(diào)節(jié)分子與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)器官密切聯(lián)系，與這些系統(tǒng)的器官組織及肝、肌細(xì)胞等之間存在細(xì)胞對(duì)話，因此具有復(fù)雜的內(nèi)分泌及代謝功能。例如脂肪組織能夠分泌性激素，特別是雌激素；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、瘦素(leptin，LP)及白細(xì)胞介素-8(IL-8)等的信號(hào)也是由脂肪組織分泌的，白細(xì)胞介素-6(IL-6)約1/3是由脂肪組織合成分泌的[8]。

此外，近年來(lái)有研究表明脂肪酸本身也能間接的誘導(dǎo)如IL-6等非特異性免疫相關(guān)的一些細(xì)胞因子的表達(dá)[9]。這是因?yàn)橹炯?xì)胞和炎性細(xì)胞中的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)及其他受體的相互作用被其激活，而TLR4與肥胖、慢性炎癥有著一定的聯(lián)系[10]。

IL-6是一種由多種細(xì)胞分泌，且作用于多種細(xì)胞的細(xì)胞因子，其作用包括刺激活化免疫細(xì)胞、參與炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)應(yīng)激應(yīng)答等。同時(shí)作為重要炎性因子的IL-6，其在炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大中有重要意義，其表達(dá)水平與炎癥進(jìn)展在一定程度上呈正相關(guān)[11]。另外，KRALISC等[12]研究顯示IL-6能下調(diào)visfatin mRNA在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá)。王淑艷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清visfatin水平與IL-6水平呈正相關(guān)。

因此，本試驗(yàn)以海蘭褐蛋雞為研究對(duì)象，采用高能低蛋白日糧飼喂構(gòu)建FLHS疾病模型，比較FLHS蛋雞病理組織形態(tài)差異，進(jìn)一步比較FLHS蛋雞血清IL-6含量水平及脂肪組織中IL-6 mRNA表達(dá)差異變化，從而探討高能低蛋白日糧誘導(dǎo)的FLHS蛋雞脂肪組織的代謝差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組80只(其中80%處于產(chǎn)蛋高峰期)海蘭褐蛋雞以籠養(yǎng)的方式預(yù)飼養(yǎng)1周，無(wú)應(yīng)激等異常狀態(tài)，將其隨機(jī)分為病理組與對(duì)照組。對(duì)照組給予基礎(chǔ)日糧，病理組給予高能量低蛋白日糧。自由采食與飲水，每日早、晚各飼喂1次，并進(jìn)行免疫接種和常規(guī)驅(qū)蟲。給予16 h光照，并保持舍內(nèi)溫度在28～32℃。不同日糧飼喂40 d后采集組織樣品，若通過(guò)高能低蛋白日糧飼養(yǎng)的蛋雞中超過(guò)70%發(fā)生FLHS，則表明FLHS模型建立成功[16]。飼喂80 d后采集相關(guān)組織樣品進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)日糧實(shí)驗(yàn)蛋雞所用基礎(chǔ)日糧依據(jù)NRC(1994)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)蛋雞營(yíng)養(yǎng)需要量配置而成，其配方組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。日糧配方參照文獻(xiàn)[14]配方，對(duì)照組使用的基礎(chǔ)日糧蛋能比為1.41 MJ/kg，病理組使用的高能低蛋白日糧蛋能比為0.93 MJ/kg。

表1 試驗(yàn)日糧組成配方及營(yíng)養(yǎng)水平 %

1.3 樣品的采集翅下靜脈采血后迅速處死蛋雞，打開腹腔后采集其肝臟、脂肪組織。所采集血液置于EP管中37℃靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存，用于血清含量測(cè)定。部分脂肪組織與肝臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟切片的制作與HE染色。另取脂肪組織置于EP管中并迅速浸入液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肝臟樣品石蠟切片將采集的部分脂肪組織與肝臟組織經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛溶液固定后，制作石蠟切片與HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)觀察。

1.5 熒光定量PCR法測(cè)定

1.5.1RNA的提取和cDNA的合成 取適量于-80℃ 保存的新鮮脂肪組織，置于預(yù)先裝有1 mL RNAiso Plus的EP管中，用研磨棒在保持低溫的條件下研磨成勻漿，采用Trizol法提取總DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性與濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，分為2個(gè)步驟進(jìn)行。采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系1(10 μL)：gDNA Eraser 1 μL，RNase Free dH2O 6 μL， 5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，模板 1 μL，42℃ 2 min，去除gDNA；采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2(10 μL)，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 μL，5×PrimeScript Buffer2 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，RT primer Mix 1 μL，37℃ 15 min，獲得cDNA。

1.5.2目的基因PCR擴(kuò)增、引物設(shè)計(jì)及檢驗(yàn) 本試驗(yàn)所用IL-6的基因序列來(lái)源于GenBank發(fā)表在NCBI中的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表2)。以β-actin為內(nèi)參基因，目的基因擴(kuò)增片段需通過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)無(wú)誤后確定。

表2 目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增引物信息

1.5.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 通過(guò)ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行real-time Q-PCR分析(模板：反轉(zhuǎn)錄所得cDNA；內(nèi)參基因：β-actin)，所得數(shù)據(jù)在內(nèi)參基因與目的基因擴(kuò)增效率相近的前提下，樣品每個(gè)重復(fù)3次。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 17.0進(jìn)行單因素ANOVA分析。試驗(yàn)結(jié)果以x±s表示：P<0.05表示差異顯著；P>0.05表示差異不顯著；P<0.01表示差異極顯著。利用2-△△Ct公式進(jìn)行計(jì)算，獲得目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)豐度。試驗(yàn)結(jié)果用Graphpad prism 8.0軟件作圖，脂滴(LDs)大小通過(guò)Image-J軟件獲取。

2 結(jié)果

2.1 剖檢剖解后可見FLHS組的腹腔內(nèi)有明顯的脂肪沉積，肝臟體積變大，組織松脆，表面黃染，油膩(圖1A)。對(duì)照組肝臟體積正常，觸感柔軟，顏色光澤、鮮艷正常(圖1B)。

圖1 肝臟解剖圖(n>10) A.FLHS組；B.對(duì)照組

2.2 HE染色

2.2.1肝臟組織HE染色 結(jié)果顯示，F(xiàn)LHS組中，肝臟細(xì)胞相對(duì)松散，發(fā)生脂肪變性，細(xì)胞間質(zhì)與胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多脂肪空泡，細(xì)胞核向細(xì)胞邊緣移動(dòng)(圖2A)。對(duì)照組肝臟細(xì)胞邊界清晰，排列整齊，未出現(xiàn)脂肪空泡(圖2B)。

圖2 肝臟組織HE染色圖(n>10) A.FLHS組；B.對(duì)照組

2.2.2脂肪組織HE染色 FLHS組脂肪組織HE染色如圖3A所示，對(duì)照組脂肪組織HE染色如圖3B所示，對(duì)照組及試驗(yàn)組LDs直徑大小比較如圖4所示。結(jié)果表明，對(duì)照組的脂肪空泡更加密集且更小，而FLHS組LDs直徑顯著大于對(duì)照組LDs(P<0.05)。

圖3 脂肪組織HE染色圖(n>10) A.FLHS組；B.對(duì)照組

圖4 LDs大小比較(n=17) 注：*示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。下同

2.3 血清IL-6水平由表3可見，F(xiàn)LHS組血清IL-6水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表3 血清IL-6水平檢測(cè)結(jié)果(n>10)

2.4 IL-6在FLHS脂肪組織中的表達(dá)圖5結(jié)果顯示，脂肪組織的IL-6表達(dá)在對(duì)照組與FLHS組中差異顯著(P<0.05)。

圖5 IL-6在脂肪組織中的表達(dá)差異(n=6)

3 討論

3.1 FLHS病理模型的建立蛋雞FLHS在集約化蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)疾病中較為常見。其以脂肪在肝臟中過(guò)度沉積，表面呈土黃色且油膩，并伴有出血等為典型癥狀。FLHS產(chǎn)生的原因主要為遺傳、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境以及激素等，而營(yíng)養(yǎng)不均衡是目前在集約化蛋雞養(yǎng)殖中發(fā)生FLHS的主要誘因。目前蛋雞FLHS模型的建立方法有很多種：董曉芳等[18]通過(guò)外源注射雌二醇成功建立蛋雞FLHS模型；姜錦鵬

等[19]通過(guò)飼喂復(fù)合高脂日糧與雌激素肌肉注射也成功建立蛋雞FLHS模型。同時(shí)有研究表明飼喂高能低蛋白日糧可誘導(dǎo)FLHS的發(fā)生。左文君[20]通過(guò)飼喂含?；撬岬母吣艿偷鞍罪暭Z成功建立蛋雞FLHS模型；黃恩福[14]和郭小權(quán)等[21]通過(guò)飼喂高能量低蛋白日糧成功建立蛋雞FLHS模型；邢玉娟等[22]通過(guò)飼喂不同配比的高脂飼料成功建立蛋雞FLHS模型等。本試驗(yàn)飼喂海蘭褐蛋雞高能低蛋白日糧80 d后，病理組的剖檢結(jié)果以及肝臟組織的HE染色與對(duì)照組結(jié)果對(duì)比：病理組蛋雞肝臟表面呈現(xiàn)黃褐色且油膩，HE染色結(jié)果呈現(xiàn)許多脂肪空泡等，以上結(jié)果表明肝臟中脂肪過(guò)度沉積，進(jìn)而表明FLHS模型成功建立。

3.2 高能低蛋白日糧對(duì)肝臟組織的影響脂肪組織是重要的能量代謝器官，機(jī)體多余的能量主要儲(chǔ)存于脂肪組織中。動(dòng)物脂肪細(xì)胞LDs是中性脂肪的儲(chǔ)存庫(kù)，因此LDs的主要作用是儲(chǔ)存能量。本試驗(yàn)脂肪組織HE染色結(jié)果顯示：FLHS組中的脂肪細(xì)胞LDs的直徑顯著大于對(duì)照組。這一結(jié)果表明本試驗(yàn)中過(guò)多的能量攝入導(dǎo)致蛋雞能量過(guò)剩，從而儲(chǔ)存在脂肪組織中，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的LDs直徑增大。

3.3 高能低蛋白日糧對(duì)IL-6含量的影響脂肪組織不僅是能量代謝器官，同時(shí)也是重要的內(nèi)分泌器官。研究表明，脂肪組織是IL-6的主要生成場(chǎng)所，同時(shí)IL-6作為抗炎癥細(xì)胞因子之一，在正常水平對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。WANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸可通過(guò)Toll樣受體4及其他受體相互作用，啟動(dòng)以信號(hào)通路為代表的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)。本試驗(yàn)血清生化指標(biāo)結(jié)果表明：FLHS組蛋雞血清IL-6含量極顯著的高于對(duì)照組(P<0.01)，與賴敏等[23]對(duì)非酒精性脂肪肝患者血清IL-6含量檢測(cè)結(jié)果十分相似，提示高能量低蛋白日糧誘導(dǎo)的FLHS，可引起脂肪組織炎性反應(yīng)，進(jìn)而推測(cè)可能是FLHS發(fā)展過(guò)程中引發(fā)胰島素抵抗等的并發(fā)癥原因之一。

王楠楠等[24]研究表明，通過(guò)給予大鼠飼喂一段時(shí)間的植物油可導(dǎo)致大鼠脂肪增多、蓄積，且脂肪細(xì)胞IL-6的表達(dá)水平顯著提升(P<0.05)；BUETTNER[25]通過(guò)飼喂基于豬油、魚油、橄欖油等高脂肪飼料導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)明顯的肥胖、血脂升高及脂肪組織IL生成增多，進(jìn)而引發(fā)胰島素抵抗等。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。這些結(jié)果提示了脂肪細(xì)胞出現(xiàn)代謝異常，甘油三酯大量蓄積促進(jìn)了脂肪組織IL-6 mRNA的表達(dá)水平。同時(shí)表明IL-6的水平對(duì)于FLHS的發(fā)生、發(fā)展有重要的意義，但I(xiàn)L-6的水平升高對(duì)FLHS的發(fā)生、發(fā)展所產(chǎn)生的影響有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，高能低蛋白日糧的飼喂可成功誘導(dǎo)FLHS的發(fā)生；FLHS組中的脂肪細(xì)胞LDs的直徑顯著增大；FLHS的蛋雞血清IL-6含量極顯著性升高(P<0.01)，同時(shí)FLHS蛋雞脂肪組織IL-6的mRNA表達(dá)水平也顯著性升高(P<0.05)，表明高能低蛋白日糧誘導(dǎo)的FLHS蛋雞脂肪組織出現(xiàn)代謝異常。