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        圣草酚促進miR-128緩解金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺上皮細胞炎性損傷

        2020-11-06 04:46:50陳鵬舉史迎迎趙慶楓張光輝
        中國獸醫(yī)學報 2020年10期
        關鍵詞:水平

        陳鵬舉,史迎迎,趙慶楓,張光輝*

        (1.河南省現代中獸醫(yī)研究院,河南 鄭州 450002;2.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002;3.周口職業(yè)技術學院,河南 周口 466001)

        乳腺炎是乳腺組織受病原微生物等感染和損傷所引起的炎性反應,是奶牛泌乳期間常發(fā)的疾病之一,會引起奶牛產奶量下降、乳汁質量不佳及死淘率增加等,嚴重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經濟效益。金黃色葡萄球菌(金葡菌)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一[1-2]。金葡菌一旦在牛群中傳播,會引起奶牛包括慢性乳腺炎在內的多種疾病,且很難根治。因此,準確的診斷及治療乳腺炎對奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重大的經濟價值。

        microRNAs (miRNAs)是一類約由22個核苷酸分子組成的小型非編碼RNA,在多種物種中廣泛存在。miRNA通過與其靶mRNA相互作用,進而參與到mRNA轉錄后調節(jié)的過程中[3-5]。隨著對miRNA研究的逐漸深入,發(fā)現其參與到多種疾病發(fā)生發(fā)展的過程中,并起到了較好的調控作用。有研究表明,miRNA在炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的作用,如類風濕關節(jié)炎[6]、腎臟炎[7]和心肌炎[8]等。圣草酚是一種多酚黃酮類化合物,在蔬菜和水果中廣泛存在[9-10]。圣草酚在細胞炎癥和氧化等方面研究廣泛,其不僅能夠治療疾病,還能對疾病起到一定的預防作用[11-12]。越來越多的研究表明,藥物與miRNA之間的互作可以起到對疾病的治療作用。姜黃素通過提高miR-122的表達從而起到抗腫瘤的作用[13],丹參酮ⅡA通過下調miR-1的表達對缺血心肌具有保護作用[14]。但是,圣草酚與miRNA之間是否具有互作機制尚未見報道,還需要進一步探討。

        miRNA-128(miR-128)是眾多miRNA家族中的一員,參與到動脈粥樣硬化和結直腸癌等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中[15-16]。髓樣分化因子(MyD88)是Toll信號通路中的一個關鍵因子,在炎癥等疾病中起到信息傳遞的作用[17-18],但miR-128與MyD88在奶牛乳腺炎中的作用機制尚不清楚。此外,在炎性反應中,圣草酚是否與miR-128共同作用依然未知,需要進一步探討。因此,本試驗旨在探究圣草酚與miR-128在奶牛乳腺炎疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機理。

        1 材料與方法

        1.1 金葡菌的培養(yǎng)金葡菌 (ATCC 25923)在37℃、200 r/min的搖床上進行培養(yǎng),保存于含有25%甘油的LB培養(yǎng)基中,-80℃凍存。將過夜培養(yǎng)的金葡菌重新接種到新鮮LB培養(yǎng)基中,生長至對數增長期,用離心法收集細菌,清洗并在生理鹽水中以適合的濃度重懸,以獲得最終接種物的密度。菌落形成單位(CFU)的接種量經連續(xù)稀釋和平板計數法確認。

        1.2 乳腺上皮細胞的培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞(MAC-T)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

        1.3 CCK-8測試為檢測滅活的金葡菌和圣草酚(B21160,上海源葉生物科技有限公司)是否影響細胞活力,采用CCK-8檢測試劑盒(Beyotime)檢測MAC-T細胞活力。于37℃、0.2%甲醛滅活金葡菌24~48 h,以保持金葡菌的完整形態(tài),防止細菌生長而不產生細胞毒性。細胞接種于96孔板,密度約為4.5×104細胞/孔,于接種后0,6,12,24 h分別用金葡菌(MOI=10)刺激細胞,圣草酚分別用5,10,20 μmol/L 的量處理細胞,用新培養(yǎng)基替代孔內舊培養(yǎng)基,并加入CCK-8試劑。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用酶標儀(Thermo scientific Multiskan MK3,USA)測量D450 nm值。

        1.4 miR-128模擬物及抑制劑的轉染miR-128模擬物(mimics)和抑制物(inhibitor)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。按照轉染試劑說明書,將miR-128 mimics、inhibitor和其各自的陰性對照mimic NC和inhibitor NC用轉染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen)轉染進MAC-T細胞中,在轉染4~6 h后更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集樣品。

        1.5 MAC-T細胞RNA的提取及反轉錄用Trizol(Invitrogen)提取MAC-T細胞中總的RNA,然后用反轉錄試劑盒(諾唯贊,南京)通過莖環(huán)法進行miR-128的反轉錄。

        1.6 實時熒光定量PCR用SYBR Green染料法進行miR-128及TNF-α、IL-1β和IL-6的測定,通過公式2-ΔΔCt計算其各自的表達量,用于定量的基因引物序列如表1所示。

        表1 炎性細胞因子引物序列

        1.7 雙熒光素酶試驗通過生物信息學網站分析得知MyD88是miR-128的預測靶基因,將MyD88 mRNA 3′UTR 區(qū)域的野生型(WT-3′UTR)和突變型(MuT-3′UTR)擴增片段分別連接到psi-CHECK2載體上,使用LipofectamineTM2000將野生型及突變型載體和miR-128 mimics 或inhibitor及陰性對照共同轉染至293T細胞,24 h后裂解細胞,使用雙熒光素酶報告基因系統評估報告基因活性。

        1.8 ELISA試驗按照ELISA試劑盒(Bio-Swamp)說明書方法將收集的細胞上清液用于定量TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達水平的測定。使用酶標儀測量D450 nm值,并通過線性標準曲線計算TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

        1.9 數據分析通過GraphPad Prism 6.0進行數據的計算和處理,各組數據以x±sx表示,并用t檢驗、Two-way ANOVA進行各組數據之間差異性的分析,P<0.05表示差異顯著。

        2 結果

        2.1 金葡菌和圣草酚的細胞毒性檢驗為了探討miR-128在MAC-T細胞中的表達變化,首先檢測圣草酚和滅活的金葡菌是否具有細胞毒性作用,通過用CCK-8試劑盒檢測MAC-T細胞,結果表明,在MOI為10時,滅活的金葡菌對MAC-T細胞的存活率沒有影響,圣草酚在3種劑量下也無明顯的細胞毒性作用(圖1)。

        圖1 金葡菌和圣草酚對MAC-T細胞活力的影響 A.金葡菌對MAC-T細胞活力的影響;B.圣草酚對MAC-T細胞活力的影響

        2.2 金葡菌和圣草酚對miR-128表達水平的影響為了檢測miR-128在炎性反應中表達水平的變化,用金葡菌刺激MAC-T細胞,結果發(fā)現,miR-128的表達水平隨時間變化逐漸降低,且在12 h降到最低。因此,選取12 h這一刺激節(jié)點,通過運用圣草酚,結果表明圣草酚會促進在金葡菌刺激下miR-128的表達(圖2)。

        圖2 金葡菌和圣草酚對miR-128表達水平的影響 A.金葡菌對miR-128表達水平的影響;B.圣草酚對miR-128表達水平的影響。*表示差異顯著。下同

        2.3 圣草酚對miR-128轉染下的炎性因子表達水平的影響為了進一步驗證miR-128對炎癥因子表達的影響,使用miR-128 mimics或miR-128inhibitor轉染MAC-T細胞,結果發(fā)現,轉染mimics和inhibitor后,miR-128的表達水平穩(wěn)定,表明miR-128的轉染效率穩(wěn)定。此外,miR-128 mimics組顯著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平,而miR-128 inhibitor則顯著提高TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平。在使用圣草酚進一步處理之后,圣草酚會顯著降低mimics轉染下TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平,同時也顯著升高inhibitor轉染下TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平(圖3)。

        圖3 圣草酚對miR-128轉染下的炎性因子表達水平的影響 A,B.miR-128分別在mimics和inhibitor轉染后的表達水平;C~E.圣草酚對miR-128 mimics轉染下TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響;F~H.圣草酚對miR-128 inhibitor轉染下TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響

        2.4 雙熒光素酶試驗驗證結果為了確認miR-128與MyD88之間的靶向關系,通過雙熒光素酶試驗進行驗證。結果顯示,在WT-3′UTR中,miR-128 mimics組的熒光素酶活性顯著高于mimic NC組,而在MuT-3′UTR中,miR-128 mimics組和mimic NC組之間無顯著性差異;由此可知,MyD88是miR-128的一個靶基因(圖4)。

        圖4 miR-128通過直接靶向3′UTR調控MyD88的表達

        2.5 圣草酚對si-MyD88轉染下的炎性因子表達水平的影響通過干擾MyD88,探究MyD88在炎癥中的作用機制。結果顯示,敲低MyD88后,TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表達水平會顯著升高,且在圣草酚處理之后,TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表達水平會進一步降低(圖5)。

        圖5 圣草酚對si-MyD88轉染下炎性因子表達水平的影響

        3 討論

        奶牛乳腺疾病是關乎奶牛養(yǎng)殖業(yè)安危的關鍵問題,而在日常的養(yǎng)殖及擠奶環(huán)境下,乳腺疾病的發(fā)生同樣不可避免。金葡菌是引起奶牛疾病常見的一種病原菌,常會引起乳腺炎和子宮內膜炎[19-20],奶牛一旦感染就會很難根治。因此,有效預防及治療奶牛乳腺炎顯得至關重要。

        近年來,人們對miRNA的研究日益增多,miRNA參與到多種疾病的治療之中,其中在腫瘤方面的研究較為廣泛。miR-128在腫瘤方面的研究也較多,有報道表明,miR-128會通過HTERT調控乳腺腫瘤啟動細胞的自我更新[21]。此外,miR-128還能抑制腫瘤的生長和血管的生成[22]。本試驗首先探究了miR-128對乳腺炎的治療作用,結果顯示,miR-128會抑制相關炎性因子的表達。在奶牛乳腺炎治療方面,miRNA是一種新型的方法。圣草酚屬于一種天然二氫黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化及神經保護等方面的作用[23-26]。有研究表明,圣草酚會參與NF-κB這一經典炎性通路的調節(jié),在炎性反應中發(fā)揮著重要的作用[27]。本試驗將圣草酚介入到miR-128的調控中,結果發(fā)現圣草酚會促進miR-128的表達,且會進一步增強miR-128對炎性反應的抑制作用。

        miRNAs通過阻斷翻譯或誘導靶基因的降解,為基因表達的轉錄后調控提供了一條新的途徑。這一過程被認為是miRNAs組織和細胞類型特異性表達的主要控制機制。miRNAs主要通過與其靶mRNA作用,進而發(fā)揮其調控作用。盡管生物信息學網站預測了許多miR-128的靶基因,但其中某些靶基因可能與miR-128之間沒有作用。到目前為止,已經通過試驗驗證了包括蛋白受體、細胞外基質糖蛋白和激酶在內的許多基因是miR-128的靶標[28-30]。在本試驗中,通過TargetScan、miRBase和miRWalk網站預測到MyD88是miR-128的一個靶基因。雙熒光素酶試驗結果發(fā)現,miR-128 WT-3′UTR的熒光素酶活性顯著降低。這些數據表明,MyD88是金葡菌刺激后miR-128的靶點。

        MyD88在IL-1刺激后被募集到IL-1受體復合物中,與IRAK結合后會介導IRAK與受體的結合[31]。此外,MyD88下游與NF-κB信號通路相關聯,在炎癥相關疾病中作用重大。MyD88的抑制也進一步導致下游促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達受到抑制,緩解炎性反應[32],這與本試驗結果相一致。此外,圣草酚的添加進一步增強MyD88的干擾所引起的TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平的抑制作用。

        綜上所述,本試驗證明miR-128通過抑制MyD88來抑制金葡菌誘導的MAC-T細胞的炎性反應,且圣草酚進一步增強miR-128對炎性反應的抑制作用。miR-128介導的轉錄后調控可能參與了金葡菌誘導MAC-T細胞炎性反應的微調。雖然本試驗發(fā)現圣草酚增強miR-128的表達,但其中的作用機制還不清楚,可能與miR-128的靶基因有關,有待于進一步的研究。

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