徐祖敏，楊 俊，鄧于紅，賀紅桂，史華帝，左瑜芳 （廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東湛江 524001）

癌癥是全世界面臨的公共衛(wèi)生問題之一[1]，而肺癌患者的死亡率位居所有癌癥之首[2]。大多數(shù)肺癌在確診時(shí)已為晚期，晚期肺癌5年總生存率＜5%[3]。目前，放療在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治療中具有重要的作用，能夠改善腫瘤患者的預(yù)后[4]。但是由于放射抵抗，制約了其療效，亦是造成治療失敗的主要原因之一。因此，尋找新型抗腫瘤藥物及低毒高效的腫瘤放射增敏劑，提高放射線對(duì)NSCLC的療效是目前的研究熱點(diǎn)?？鄥A(C15H24N2O)屬于四環(huán)喹嗪啶類生物堿，是傳統(tǒng)中藥豆科植物苦參分離提純后的活性成分，有著廣泛的生物學(xué)活性，如鎮(zhèn)痛、控制血脂、抗感染、抗氧化和抗腫瘤等[5]。前期研究表明苦參堿對(duì)多種腫瘤具有抗腫瘤作用，包括鼻咽癌、甲狀腺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等[6-11]，但是苦參堿與放射治療聯(lián)合對(duì)NSCLC細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。本研究擬在體外實(shí)驗(yàn)中探討苦參堿對(duì)NSCLC細(xì)胞的毒性作用，以及苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC細(xì)胞放射敏感性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

人非小細(xì)胞肺癌H1299、A549細(xì)胞株在37℃、5%CO2飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清(Biological Industries)、1%青霉素(哈藥集團(tuán))、1%鏈霉素(哈藥集團(tuán))的RMPI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代以及開展后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?？鄥A購自上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購自碧云天生物公司，Phospho-Histone H2AX抗體購自Cell Signaling Technology，GAPDH 抗體購自碧云天生物公司。

1.2 射線照射

醫(yī)科達(dá)直線加速器 ，照射前由物理師制定放療計(jì)劃并交由技師進(jìn)行操作。常溫下置于直線加速器(醫(yī)科達(dá)，瑞典)4MV X線按放療計(jì)劃單的不同劑量進(jìn)行照射，源皮距(SSD)=100 cm，培養(yǎng)皿底部加1.5 cm厚等效組織補(bǔ)償膜。

1.3 CCK-8法檢測(cè)苦參堿對(duì)NSCLC細(xì)胞作用

取對(duì)數(shù)生長期的H1299和A549細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入含不同藥物濃度的培養(yǎng)液(含1%FBS)100 μL/孔，使藥物最終質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、1、2、4、8 g/L，每組藥物濃度至少3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，分別加入含有10% CCK-8的無血清RMPI-1640培養(yǎng)基100 μL/孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育2 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。細(xì)胞抑制率= 1-(OD加藥-OD空白對(duì)照) /(OD對(duì)照-OD空白對(duì)照)×100%。應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的H1299和A549細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液平均密度為10個(gè)/μL，按100、200、400、800和1 600個(gè)/孔的密度梯度將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)箱孵育24 h，分別設(shè)為放療組和苦參堿聯(lián)合放療組。于放療前24 h加入含0.5 g/L苦參堿的完全培養(yǎng)基(含10% FBS)，24 h后放療組和苦參堿聯(lián)合放療組給予不同劑量照射，劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育12 h，隨后更換新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，然后固定、染色、計(jì)數(shù)。存活分?jǐn)?shù)(SF)=受照射細(xì)胞的克隆形成率÷對(duì)照組細(xì)胞克隆形成率×100%，克隆形成率%=克隆數(shù)÷接種細(xì)胞數(shù)×100%。使用Graph Pad Prism 5.0軟件，以多靶單擊模型y=1-[1-exp(-k×x)]^N擬合細(xì)胞存活曲線，并計(jì)算放射增敏比(SER)。

1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長期的H1299和A549細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，按10×104個(gè)/皿細(xì)胞數(shù)接種至6 cm培養(yǎng)皿，分為對(duì)照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯(lián)合放療組，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，更換含0.5 g/L苦參堿的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后以6 Gy劑量進(jìn)行放療，細(xì)胞放療24 h后提取細(xì)胞總蛋白。定量上樣30 μg/泳道，采用10%，15% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，電壓為100 V，時(shí)間約120 min。將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電流調(diào)節(jié)為300 mA，90 min。轉(zhuǎn)膜后置于含5% 脫脂奶粉封閉液中，常溫下?lián)u床封閉1 h。封閉后，一抗?jié)舛?:1 000，4 ℃冰箱孵育過夜?；厥找豢?，用新鮮配好的緩沖溶液洗膜3次，每次約10 min，然后用非同一種屬二抗?jié)舛?:5 000～1:10 000，室溫?fù)u床上孵育1 h，用新鮮配好的TBST洗膜3次，每次約10 min。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的HRP-ECL高靈敏度發(fā)光液于暗室中均勻地涂抹于膜的表面，X線膠片曝光，將膠片分別置于顯影液、定影液中約5 min，待膠片干燥后掃描膠片。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期的H1299和A549細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按10×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，分別設(shè)為對(duì)照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯(lián)合放療組，每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，相應(yīng)的更換含0.5 g/L苦參堿的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后以6 Gy劑量進(jìn)行放療，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌3次，1 000 r/ min離心5 min，用100 μL的Binding Buffer工作液懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻，隨后加入400 μL的Binding Buffer工作液，室溫，避光，孵育5～15 min，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例，至少重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)或Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)NSCLC細(xì)胞的影響

在0.25～8 g/L范圍內(nèi)，H1299、A549的細(xì)胞存活率隨著作用濃度的增加及作用時(shí)間的延長而顯著降低(P＜0.01)，見圖1。

2.2 苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC放射敏感性的影響

與單純放療相比，苦參堿聯(lián)合放療能夠明顯降低H1299和A549細(xì)胞克隆數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)，詳見圖2。H1299和A549細(xì)胞的放射增敏比(SER值)分別是1.22和2.02，二者SER值均＞1，表明苦參堿可增強(qiáng)NSCLC放射敏感性。

2.3 苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC細(xì)胞DNA雙鏈斷裂相關(guān)蛋白γ-H2AX的影響

苦參堿聯(lián)合放療組的γ-H2AX蛋白表達(dá)水平較苦參堿組和放療組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

2.4 苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC細(xì)胞凋亡的影響

H1299細(xì)胞中對(duì)照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯(lián)合放療組的細(xì)胞凋亡率分別是(5.60±0.60)%、(8.86±1.38)%、 (8.78±3.10)%、 (19.80±1.28)%；A549細(xì)胞中對(duì)照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯(lián)合放療組的細(xì)胞凋亡率分別是(6.32±1.51)%、(14.90±4.29)%、(13.23±3.12)%、(24.55±5.26)%?？鄥A聯(lián)合放療組的H1299和A549細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組(P＜0.01或0.05)。詳見圖4。

圖1 苦參堿對(duì)NSCLC細(xì)胞的影響

圖2 苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC細(xì)胞放射敏感性的影響

圖3 苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC細(xì)胞DNA雙鏈斷裂相關(guān)蛋白γ-H2AX的影響

3 討論

苦參堿有著廣泛的生物學(xué)活性，其抗腫瘤的作用越來越受到重視。我們的研究表明，苦參堿可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，與前期研究結(jié)果一致[12-16]。此外，苦參堿聯(lián)合放療組能夠顯著降低細(xì)胞的克隆數(shù)，效果優(yōu)于放療組和苦參堿組，其在H1299、A549細(xì)胞中的放射增敏比分別為1.22和2.02，表明苦參堿可以增加NSCLC細(xì)胞的放射敏感性。

在肺癌的治療過程中超過一半的患者會(huì)用到放療作為治療的手段。放療可直接或間接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA損傷，從而觸發(fā)DNA損傷修復(fù)信號(hào)，招募相關(guān)DNA損傷修復(fù)因子進(jìn)行修復(fù)[17]。核心組蛋白(H2A)家族，其成員包括H2A1、H2A2、H2AZ、H2AX、H2ABbD、 macroH2AX1和 macroH2AX2。 H2AX作為其中一員，與放療關(guān)系最為密切。當(dāng)放療引起DNA雙鏈斷裂時(shí)，組蛋白H2AX被迅速招募到斷裂部位，并磷酸化為γ-H2AX，啟動(dòng)DNA修復(fù)。所以γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂損傷的標(biāo)志。DNA雙鏈斷裂損傷越多形成的γ-H2AX灶點(diǎn)數(shù)目也越多[18]。為了進(jìn)一步闡明苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC細(xì)胞DNA雙鏈斷裂以及對(duì)γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響，本研究通過收集不同分組和不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，檢測(cè)γ-H2AX蛋白表達(dá)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿聯(lián)合放療組γ-H2AX表達(dá)水平較放療組和苦參堿組顯著增加，且放療后4 h γ-H2AX蛋白的表達(dá)較放療后1 h表達(dá)水平高，提示苦參堿聯(lián)合放療可增加DNA雙鏈的斷裂。

放療可以直接誘導(dǎo)照射細(xì)胞的凋亡或程序性細(xì)胞死亡，而且凋亡也是放射治療誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的主要機(jī)制[19]。無論是苦參堿還是放射治療，都可以誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的凋亡。為了進(jìn)一步證實(shí)苦參堿聯(lián)合放療對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響，我們運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)苦參堿單獨(dú)作用于NSCLC細(xì)胞時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，且當(dāng)其與放療聯(lián)合作用后，NSCLC細(xì)胞凋亡更明顯，提示苦參堿聯(lián)合放療可增強(qiáng)誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的凋亡。

圖4 苦參堿聯(lián)合放療對(duì)NSCLC細(xì)胞凋亡的影響

綜上所述，苦參堿可通過增加DNA雙鏈的斷裂誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而增加放射線對(duì)NSCLC細(xì)胞的殺傷作用。苦參堿或可作為有效的放射增敏劑，可望為NSCLC的放射增敏治療提供新的選擇。