李曉玲，黃仲，劉美蓮

廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心1、腫瘤中心肺部腫瘤病區(qū)2，廣東 湛江 524001

肺癌是目前全球范圍內(nèi)眾多惡性腫瘤類別中發(fā)病率最高的癌癥，有權威大規(guī)模統(tǒng)計顯示，中國位居世界肺癌發(fā)病率和病死率的榜首[1]，且呈顯著上升的趨勢，已經(jīng)成為嚴重威脅中國人群健康的主要公共衛(wèi)生問題之一，備受社會各界關注。隨著肺癌個體化靶向治療理念的飛躍，2019 版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(national comprehensive cancer network，NCCN)指南更新，明 確 非 小 細 胞 肺 癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)在治療前應檢測基因狀態(tài)[2]。然而遺憾的是，2/3 以上的肺癌患者在確診時已屬晚期，錯過手術時機，臨床難以獲取腫瘤實體標本。作為晚期肺癌患者常見的并發(fā)癥，胸水標本的獲取相當簡單而安全。采用胸水標本進行表皮生長因子(epithelial growth factor receptor，EGFR)突變的檢測有兩個路徑，其一是臨床醫(yī)生將即時獲取的“新鮮”胸水樣本直接送到分子病理室檢測，其二是臨床醫(yī)師將獲取的胸水樣本先送到常規(guī)細胞病理室，由細胞病理技術人員制作成細胞蠟塊，由病理診斷醫(yī)師做好蠟塊切片質(zhì)控(確定有一定量的腫瘤細胞數(shù))后交由分子病理室進一步檢測。從臨床的角度，第一個路徑簡單、方便、快捷，第二個路徑流程較為繁瑣，費時較長。那么，從病理精準的角度，兩個路徑檢測的結果是否一致？本研究旨在探討胸水細胞蠟塊與“新鮮”胸水在肺腺癌EGFR基因檢測中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2018 年1 月至2019 年6 月在廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院住院治療的胸腔積液患者67 例，一份胸水常規(guī)涂片及制作成細胞蠟塊，切片經(jīng)免疫組織化學染色明確為肺腺癌而進一步檢測EGFR(實驗組)，另一份“新鮮”胸水直接檢測EGFR(對照組)。每份胸水均為臨床醫(yī)生經(jīng)胸腔穿刺術現(xiàn)抽即送的合格標本。

1.2 方法

1.2.1 制備細胞蠟塊 取胸水100 mL 置于兩管50 mL 離心管內(nèi)，離心(5 min，800×g)，棄上清液，滴入1～3 滴試劑A，震蕩，使細胞與試劑A 充分混合，離心(2 min，800×g)，取出離心管，棄掉多余上清后滴入2～3滴試劑B，輕晃試管，靜置30 s，待細胞塊與離心管底部分離，用軟吸管將細胞塊吸起，轉移到包埋紙上包好，置入包埋盒，經(jīng)過固定、脫水，石蠟包埋成細胞蠟塊，然后切片、蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。

1.2.2 免疫組織化學法 切片進行免疫組化染色，所用一抗CK7、TTF-1、NapsinA 均購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，采用DAKO Omnis公司最新型全自動免疫組化儀進行染色，同時設陰、陽性對照。結果判定：CK7、NapsinA腫瘤細胞胞質(zhì)著色為陽性，TTF-1 腫瘤細胞胞核著色為陽性。所選病例經(jīng)此三項肺腺癌特異抗體明確診斷。

1.2.3 EGFR基因突變檢測 細胞蠟塊切片常規(guī)脫蠟后及新鮮胸水離心處理后沉渣提取DNA。DNA提取試劑盒為廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司的核酸提取試劑盒-FFPE DNA(離心柱型)，EGFR 基因檢測試劑盒為廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司的人類EGFR 基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)。DNA提取完成后采用超微量紫外分光光度計測量其濃度及OD260/OD280，以驗證所提取的DNA 樣本是否合格，驗證合格后上機進行檢測。采用擴增阻遏突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)技術進行EGFR 基因突變檢測。應用Roche cobas z480 熒光 定量PCR 儀檢測EGFR 基因外顯子18、19、20、21(Exon18-21)上的常見已知突變。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以構成比或率(%)表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 常規(guī)病理觀察 傳統(tǒng)涂片觀察見癌細胞團(圖1A)；胸水制作成細胞蠟塊做成HE切片觀察，可見癌細胞排列成腺樣、乳頭狀，有著與實體癌組織相似的空間排列結構(圖1B、1C)；切片加做免疫組化指標TTF-1、NapsinA、CK7顯示陽性表達，協(xié)助確診肺腺癌(圖1D、1E、1F)。

圖1 胸水涂片及細胞蠟塊切片HE染色、免疫組化染色

2.2 EGFR 檢測結果 樣本有任一突變類型為EGFR陽性(圖2)，無任何突變類型為EGFR陰性(圖3)。檢測結果顯示，實驗組EGFR 突變陽性42 例，陰性25例，陽性率為62.69%(42/67)，而對照組EGFR 突變陽性30 例，陰性37 例，陽性率為44.78%(30/67)；兩組同為陽性27 例，同為陰性22 例。胸水細胞蠟塊陽性率明顯高于“新鮮”胸水，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=67.000，P=0.008＜0.05)。

圖2 EGFR陽性結果圖

圖3 EGFR陰性結果圖

3 討論

隨著人類基因組學、蛋白質(zhì)組學、腫瘤生物學技術和分子病理學技術的快速發(fā)展，研究學者對肺癌發(fā)病機制從細胞、分子、基因水平進一步的深入認識，持續(xù)不斷推進了藥物的研究與開發(fā)，肺癌的治療取得了諸多理念上的飛躍，從根本上改變了既往的傳統(tǒng)策略，發(fā)展到精準分子靶向治療時代。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinaseinhibitors，EGFR-TKIs)靶向用藥在發(fā)生EGFR敏感突變的肺腺癌患者及其他非小細胞肺癌患者的治療中，取得了顯著效果。用于檢測EGFR 基因突變的首選標本為手術切除的腫瘤組織，其次是經(jīng)皮肺穿刺組織及纖支鏡活檢組織。然而遺憾的是，多數(shù)病例確診時已屬晚期，錯過手術時機。作為晚期NSCLC患者的常見并發(fā)癥，高達60%以上肺癌患者會在病程中出現(xiàn)胸水，約15%肺癌患者于確診時就已出現(xiàn)胸水[3]，且臨床上常呈難以遏制、進行性加重的表現(xiàn)，隨著病情的進展，患者很快就出現(xiàn)胸痛、氣短、不能臥躺等癥狀，嚴重降低患者的生活質(zhì)量。而并發(fā)惡性胸水的晚期肺癌患者難以獲取腫瘤的實體活檢組織，相對而言，胸水的獲得則較為容易。此時應用胸水不僅能夠做病理的常規(guī)診斷，還能夠檢測EGFR 基因突變，有助于臨床評估靶向藥的選用，以及判斷耐藥機制等，從而更精準的制定個體化診療方案。所以，對于無法獲取組織標本檢測EGFR 突變的患者而言，通過獲取胸水檢測不失為一個不錯的選擇。

EGFR 是細胞膜上的一種跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，表達于正常上皮細胞表面，而在一些腫瘤細胞中常常過表達，與腫瘤的轉移、浸潤、預后相關。檢測非小細胞肺癌患者EGFR 基因的突變狀態(tài)，具有舉足輕重的臨床意義，是評估患者能否應用EGFR-TKIs 靶向治療的先決條件[4]。隨著分子病理技術的進步和現(xiàn)階段胸水處理方法的完善，應用胸水檢測EGFR 基因突變已成為評估NSCLC 患者EGFR 基因突變狀況的重要途徑，為臨床篩選適合應用EGFR-TKI治療的患者提供關鍵的參考價值。

而為了明確肺癌的診斷及其分型，以及后續(xù)精準治療方案的制定，務必有效保存胸水中可能極其有限的腫瘤細胞。通過常規(guī)細胞學病理技術，除了傳統(tǒng)涂片觀察，還可以將胸水制作成細胞蠟塊，做成HE 切片，不僅能夠直觀看到腫瘤細胞與實體腫瘤組織相似的空間排列結構，還可以加做一些免疫組化指標，協(xié)助腫瘤分型確診。李銳等[5]的研究顯示胸水細胞蠟塊EGFR 突變陽性率與手術標本相當，MIYOSHI 等[6]和ZHOU等[7]強調(diào)了細胞蠟塊的診斷價值，王雙雙等[8]也肯定了細胞蠟塊的重要意義。本研究表明，結合胸水細胞蠟塊和免疫組化結果不僅可明確肺腺癌診斷，在做好切片質(zhì)控(確保一定量的腫瘤細胞數(shù))后進行EGFR檢測，陽性率比“新鮮”胸水直接檢測EGFR的陽性率更高，是更為可靠的檢測路徑。尤其是在未能開展基因檢測的基層單位，“新鮮”胸水中腫瘤細胞的“保鮮”時間十分有限，其攜帶的生物學信息極易降解、丟失，從而可能出現(xiàn)假陰性，而將胸水制作成細胞蠟塊后，腫瘤細胞攜帶的生物學信息可長久保存，后續(xù)再送上級單位檢測則變得可靠，行之有效，值得推廣。