朱惠娟，朱才義

1.湖南省婦幼保健院超聲科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000

中國(guó)癌癥新增病例增長(zhǎng)迅速，其中肝癌新發(fā)病例占全世界范圍內(nèi)新發(fā)病例的54%，如何從根本上提高肝癌患者生存率、緩解病痛是目前亟待解決的問題[1]。微波消融以其更好的穿透性和更加適形的消融形狀廣泛運(yùn)用于肝癌的微創(chuàng)治療中[2]，精準(zhǔn)評(píng)價(jià)消融完全與否對(duì)于保證消融安全和提高療效意義非常重大[3]。最近有研究表明，彈性成像在微波消融的監(jiān)測(cè)與評(píng)估上具有實(shí)用的價(jià)值與廣闊的前景[4-6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)熱損傷灶不同區(qū)域內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)黃遞酶進(jìn)行定性以及半定量評(píng)估，對(duì)比研究消融灶不同硬度區(qū)的楊氏模量值與消融灶組織學(xué)、細(xì)胞酶學(xué)的變化，希望利用剪切波彈性成像(shear wave elastography，SWE)定量反映組織熱損傷程度，以探討楊氏模量定量評(píng)價(jià)微波消融組織病理改變的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料 30只新西蘭大白兔，6～10個(gè)月齡，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK＜湘>2014-0011)，對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求[倫理編號(hào)：2015(科研倫審)-024]。氯化硝基藍(lán)四唑鹽(NBT，Sigma公司，美國(guó))、氧化型輔酶Ⅰ(NAD，Sigma公司，美國(guó))、吩嗪硫酸甲酯(PMS，Sigma 公司，美國(guó))、4%乳酸鈉20 mL(中衫金橋生物公司)、麻醉劑：1%戊巴比妥鈉溶液(江萊生物科技公司)。

1.2 主要儀器及手術(shù)器械 EC0-100C型組織間實(shí)體瘤超聲引導(dǎo)微波凝固治療儀(南京億高公司)、Aixplorer 超聲波診斷儀(SuperSonic Imagine 公司)、SCI5-4 線陣探頭(頻率為4～15 MHZ，法國(guó)SuperSonic Imagine)、肝臟手術(shù)器械包(自備)。

1.3 手術(shù)方法 1%戊巴比妥鈉(1 mg/kg)麻醉。在無(wú)菌操作下于劍突下腹部正中作“人”字形切口，充分暴露肝臟，將18G 消融針穿過肋間隙，在超聲引導(dǎo)下穿過左外葉進(jìn)入左內(nèi)葉最厚處。由于兔肝較薄，消融容易損傷周圍組織，通過反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)一設(shè)置微波治療儀的參數(shù)為：輸出功率40 W，消融時(shí)間1 min。準(zhǔn)備就緒后，按預(yù)定的消融參數(shù)，進(jìn)行消融。

1.4 SWE 檢查流程 消融結(jié)束即刻行二維超聲檢查，找到消融灶的最大切面，穩(wěn)定超聲探頭同時(shí)運(yùn)行SWETM 程序。SWE 檢查采用雙幅模式，SWETM取樣框包括全部病灶范圍及周圍肝實(shí)質(zhì)，當(dāng)5～6 幀彈性成像穩(wěn)定后，SWE根據(jù)組織硬度的不同轉(zhuǎn)換成彩色圖譜。當(dāng)顏色呈現(xiàn)勻和穩(wěn)定的狀態(tài)，且整個(gè)顏色區(qū)域至少包含2/3 取樣框時(shí)，切面前方無(wú)手法過重引起顏色誤判，后方無(wú)噪聲干擾時(shí)，彈性圖變化基本一致時(shí)，認(rèn)為檢查成功。運(yùn)行SWE 測(cè)量程序(Q-BOXTM)，統(tǒng)一彈性值圈設(shè)置直徑為1 mm，將彈性值圈放在感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，包括消融區(qū)、消融周圍區(qū)、未消融區(qū)，記錄三個(gè)區(qū)域的平均楊氏模量值(SWE mean)，以kPa 表示，每個(gè)區(qū)域任意選取5個(gè)位置測(cè)量，取平均值。所有測(cè)量均為同一個(gè)醫(yī)生操作完成，每次測(cè)量必須保證超聲切面的一致性。

1.5 標(biāo)本取材及處理方法 注射過量麻醉劑處死實(shí)驗(yàn)兔，取消融灶組織并保留周圍正常組織5 mm作為檢測(cè)標(biāo)本，迅速切除消融灶組織，將標(biāo)本保證在同一個(gè)超聲切面下切開，將完整的標(biāo)本放在液氮中速凍，行OCT 包埋后做冰凍切片，行NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色法，每個(gè)標(biāo)本抽取平整無(wú)折疊4張冰凍切片。

1.6 NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色法 孵育液由硝基藍(lán)四唑鹽(NBT) 100 mg、氧化型輔酶I (NAD+)50 mg、磷酸鹽緩沖液80 mL、吩嗪硫酸甲酯(PMS)10 mg、4%乳酸鈉溶液20 mL 組成。統(tǒng)一將切片整齊放入孵育盒中，浸泡30 min，用雙蒸水沖洗切片10 min，晾干后用甘油明膠封片劑進(jìn)行封片。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：將以上孵育液不加入乳酸鈉，其他成分不變，按上述方法進(jìn)行染色作為對(duì)照。

1.7 NADH 黃遞酶染色原理 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量乳酸脫氫酶，代表了細(xì)胞的活力，它可以將底物乳酸鈉催化形成丙酮酸，同時(shí)將H+傳遞給NAD+，生成的NADH可以與硝基藍(lán)四唑鹽反應(yīng)生成藍(lán)紫色顆粒，沉淀于胞漿內(nèi)。消融灶內(nèi)細(xì)胞由于微波熱損傷而失活，線粒體內(nèi)的酶被破壞，故胞漿不染色。

1.8 酶組織化學(xué)染色定量分析 將NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色的冰凍切片放在400 倍視野下觀察，每張切片隨意選取10 個(gè)視野，利用圖像分析軟件Image-Plus 6.0 定量測(cè)量切片中NADH 黃遞酶在消融區(qū)、消融周圍區(qū)、正常未消融區(qū)表達(dá)的顆粒數(shù)量、累積光密度值(integrated optical density，IOD)，取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合非正態(tài)分布規(guī)律，以中位數(shù)M (P25，P75)表示，組間差異性比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消融后消融灶彈性變化圖及肉眼觀圖分布情況 彈性成圖根據(jù)消融后組織硬度的差異進(jìn)行彩色編碼，形成以電極為中心3個(gè)類圓形區(qū)域，即消融區(qū)(紅色區(qū)圖1A)：SWE 顯示紅色區(qū)域，楊氏模量值為高值；消融周圍區(qū)(黃色區(qū)圖1B)：SWE顯示黃綠色區(qū)域，楊氏模量值介于高值與正常值之間；未消融區(qū)(藍(lán)色區(qū)圖1C)：藍(lán)色區(qū)域，楊氏模量值為低值。肉眼觀下，消融即刻兔肝組織可分為消融區(qū)、消融周圍區(qū)和未消融區(qū)，見圖2。

圖1 兔肝組織即刻消融后的彈性成圖

圖2 兔肝組織消融后不同區(qū)域肉眼觀

2.2 彈性圖與消融即刻兔肝組織病理學(xué)變化 彈性成圖根據(jù)消融后組織硬度的差異進(jìn)行彩色編碼，形成以電極為中心3個(gè)類圓形區(qū)域(圖3)。消融區(qū)：在彈性圖變化上為紅色區(qū)域A，楊氏模量值為94.95 kPa，NADH 黃遞酶染色上未見藍(lán)染顆?；驑O少數(shù)藍(lán)染顆粒，記為-或±；消融周圍區(qū)B：彈性圖變化上為黃綠色區(qū)域，楊氏模量值為37.85 kPa，NADH黃遞酶染色顯示散在、稀疏的藍(lán)染顆粒，記為++；未消融區(qū)C：彈性圖變化上為藍(lán)色區(qū)域，楊氏模量值為10.30 kPa，NADH黃遞酶染色顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見密集、大片藍(lán)染顆粒，證明該區(qū)域內(nèi)酶有活性，細(xì)胞功能正常，記為+++。

2.3 消融區(qū)、消融周圍區(qū)和未消融區(qū)內(nèi)NADH黃遞酶表達(dá)的顆粒數(shù)量、IOD 及楊氏模量值比較 經(jīng)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：顆粒數(shù)量、IOD、楊氏模量值在消融區(qū)、消融周圍區(qū)、正常未消融區(qū)三者之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明，消融后的肝臟組織，其酶的顆粒數(shù)量、IOD、楊氏模量值在各區(qū)域存在差異性，相對(duì)于正常組織，在消融區(qū)低表達(dá)，在消融周圍區(qū)介于兩者之間；微波消融后組織明顯變硬，越靠近消融區(qū)組織硬度增大，楊氏模量值增高，越靠近正常未消融區(qū)硬度變軟，對(duì)應(yīng)的楊氏模量值降低，見表1。

2.4 楊氏模量值與NADH 黃遞酶表達(dá)的顆粒數(shù)量、IOD的相關(guān)性 楊氏模量值與NADH黃遞酶表達(dá)的顆粒數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=0.703，P＜0.001)；楊氏模量值與NADH 黃遞酶表達(dá)的IOD 呈負(fù)相關(guān)(r=0.657，P＜0.001)，見圖4和圖5。

圖3 NADH黃遞酶組織化學(xué)染色(NADH×400)

表1 消融灶三個(gè)區(qū)域內(nèi)NADH黃遞酶表達(dá)的顆粒數(shù)量、IOD以及楊氏模量值比較[M(P25，P75)]

圖4 楊氏模量值與顆粒數(shù)量的散點(diǎn)圖(r=-0.703，P＜0.001)

圖5 楊氏模量值與IOD的散點(diǎn)圖(r=-0.657，P＜0.001)

3 討論

微波消融成為治療肝臟惡性腫瘤的重要手段之一，這種高效率的手術(shù)方法已獲得了與外科手術(shù)旗鼓相當(dāng)?shù)倪h(yuǎn)期療效，更新了微創(chuàng)手術(shù)記錄[7]。精準(zhǔn)評(píng)價(jià)消融效果對(duì)于保證消融安全和提高療效意義重大，最近研究表明，彈性成像在微波消融的監(jiān)測(cè)與評(píng)估上具有實(shí)用的價(jià)值與廣闊的前景。WIGGERMANN等[8]認(rèn)為超聲彈性技術(shù)可以初步反映肝臟凝固灶的范圍；彭金波等[9]分析了彈性成像技術(shù)對(duì)射頻消融灶邊界顯示清晰，有望成為評(píng)價(jià)射頻消融灶的有效方法；本實(shí)驗(yàn)的前期研究也表明，彈性成像在評(píng)價(jià)消融灶范圍的可行性。

本研究中運(yùn)用超高速剪切波彈性成像定量評(píng)估組織硬度的技術(shù)特點(diǎn)，探討它對(duì)即刻消融灶熱損傷進(jìn)行定量評(píng)估的可行性。肝組織經(jīng)過有效熱場(chǎng)的作用發(fā)生蛋白質(zhì)變性，無(wú)疑使硬度明顯增加，彈性成圖根據(jù)消融后組織硬度的差異進(jìn)行彩色編碼，以電極為中心形成3 個(gè)類圓形區(qū)域：消融區(qū)(A)，SWE 顯示紅色區(qū)域；消融周圍區(qū)(B)，SWE 顯示黃綠色區(qū)域，正常未消融區(qū)(C)，SWE顯示藍(lán)色區(qū)域，同時(shí)觀察與測(cè)量三個(gè)區(qū)域內(nèi)的楊氏模量值分布情況，結(jié)果顯示各組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且楊氏模量值以電極為中心形成規(guī)律性地遞減，因此說明SWE 可以初步反映消融即刻組織硬度的分布情況，這與國(guó)內(nèi)、外研究一致。SUGIMOTO 等[5]對(duì)大鼠的肝臟進(jìn)行微波消融，并用3D的SWE來(lái)進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)消融灶中心、消融邊界、未消融區(qū)的楊氏模量值分別為(59.1±21.9) kPa、(43.1±1.5)kPa、(10.3±0.8)kPa，說明楊氏模量值與熱損傷的程度存在一定的相關(guān)性；其次在消融邊界的研究上，MARIANI等[10]通過對(duì)長(zhǎng)白山豬肝的射頻消融灶進(jìn)行彈性評(píng)估，將消融邊界的細(xì)胞進(jìn)行HE染色，預(yù)測(cè)豬肝組織凝固性壞死與否的彈性閾值為20 kPa。這說明SWE 的優(yōu)勢(shì)不僅可以提高常規(guī)超聲對(duì)消融范圍的辨別能力，還能夠?qū)M織的熱損傷程度提供一定的參考依據(jù)，因此，定量評(píng)估組織硬度對(duì)來(lái)判斷消融療效具有一定的前景，也給未來(lái)彈性成像在微波消融的監(jiān)測(cè)過程提供了新的研究方向。

本研究試圖從細(xì)胞學(xué)角度，探討楊氏模量值與定量評(píng)估消融熱損傷的可行性。本實(shí)驗(yàn)選取NADH黃遞酶組織化學(xué)染色來(lái)衡量細(xì)胞在即刻消融后功能上的變化，研究發(fā)現(xiàn)消融區(qū)在彈性圖變化上為紅色區(qū)域，楊氏模量值顯示最高的區(qū)域，NADH黃遞酶染色上未見藍(lán)染顆?；驑O少數(shù)藍(lán)染顆粒，記為-或±；消融周圍區(qū)在彈性圖變化上為黃綠色區(qū)域，楊氏模量值介于高值與正常值之間，NADH黃遞酶染色顯示散在、稀疏的藍(lán)染顆粒，記為++；未消融區(qū)在彈性圖變化上為藍(lán)色區(qū)域，楊氏模量值為低值的區(qū)域，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇稍擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見密集、大片藍(lán)染顆粒，記為+++。

與HE 染色相比，NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色在評(píng)價(jià)即刻消融效果上更敏感。由于消融即刻可能對(duì)細(xì)胞具有一定的熱固定作用，短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞不會(huì)發(fā)生改變，因此，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度出發(fā)，HE 染色難以判斷消融即刻細(xì)胞壞死的程度，利用酶組織化學(xué)染色可以檢測(cè)消融邊界的細(xì)胞活性[11-13]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)消融周圍區(qū)細(xì)胞呈散在陽(yáng)性，相對(duì)于正常區(qū)域內(nèi)的酶活性強(qiáng)度明顯減弱，細(xì)胞損傷程度較消融中心輕微，并且對(duì)NADH黃遞酶表達(dá)的顆粒數(shù)量、IOD在三個(gè)區(qū)域內(nèi)分布情況進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，定量分析可以更加直觀、具體地反映消融即刻組織的損傷程度與細(xì)胞活性改變。

通過Image-Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)消融區(qū)、消融周圍區(qū)、正常未消融區(qū)內(nèi)NADH黃遞酶表達(dá)的的顆粒數(shù)量、累積光密度值作定量分析，最后利用楊氏模量值與NADH黃遞酶表達(dá)的顆粒數(shù)量、IOD之間作相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)楊氏模量值與藍(lán)染的顆粒數(shù)量存在負(fù)相關(guān)，楊氏模量值與IOD存在負(fù)相關(guān)。消融區(qū)組織損傷程度高，導(dǎo)致線粒體內(nèi)酶的活性越低，楊氏模量值反而越高，越靠近正常區(qū)域壞死程度越小，細(xì)胞內(nèi)酶活性越高，楊氏模量值越小。超高速剪切波彈性成像可通過測(cè)量楊氏模量值初步定量評(píng)估微波消融的熱損傷程度。

超高速剪切波彈性成像用于微波消融的監(jiān)測(cè)還屬于初步研究階段，本實(shí)驗(yàn)是超高速剪切波彈性成像在定量評(píng)估即刻消融組織熱損傷程度上的初探，利用楊氏模量的物理特性，探討消融即刻楊氏模量值與消融即刻細(xì)胞活性改變之間的相關(guān)性。SWE 的優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)M織熱損傷程度提供一定的參考數(shù)據(jù)，其可通過測(cè)量楊氏模量值初步定量評(píng)估微波消融的熱損傷，給未來(lái)彈性成像在微波消融的監(jiān)測(cè)過程提供新的研究方向。