馮穎君， 李志嘉， 肖紫璇， 王思佳， 曾抗

(1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091)

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)作為近30年快速發(fā)展的新型治療方法，在皮膚腫瘤、感染性疾病、皮膚附屬器疾病、醫(yī)療美容中以微創(chuàng)、選擇性好、安全性高、療效佳等獨特優(yōu)勢逐漸得到廣泛的應用[1-2]。細胞自噬(cell autophagy)將受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白及其他大分子物質(zhì)等運送至溶酶體(lysosome)降解并再利用，是真核細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種平衡機制[3]。PDT可通過誘導細胞凋亡、自噬與壞死等主要途徑達到治療目的[4]。PDT引起的細胞自噬發(fā)揮雙刃劍的作用，一方面適當?shù)淖允捎欣诩毎婊?，另一方面過度的自噬促進細胞死亡。與此同時，細胞發(fā)生自噬的程度與凋亡息息相關[5]。本文就PDT誘導細胞自噬的機制及與凋亡的關系進展進行綜述，為今后相關實驗研究及臨床診療提供幫助。

1 PDT的基本原理

PDT是一種依賴于光敏劑、一定波長的光源和分子氧之間的相互作用，進而產(chǎn)生殺傷效應的新型治療方法[6]。PDT過程中本身無毒的光敏劑(photosensitizer，PS)被增殖旺盛的細胞選擇性吸收，經(jīng)過特定波長激發(fā)光的照射產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，繼而發(fā)生氧化應激損傷細胞甚至導致細胞死亡，但周圍正常的組織不受損傷，有著高度的組織選擇性[6]。近30年來，光敏劑及納米技術等的快速發(fā)展，將PDT從實驗室推向臨床，使PDT不僅在皮膚領域得到廣泛應用，現(xiàn)在還作為輔助治療用于呼吸、消化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和泌尿系腫瘤[6]。

PDT是一種結(jié)合光物理和光化學過程產(chǎn)生生物效應的治療方式。用光激發(fā)PS，是一個物理過程，隨后被激發(fā)的PS與細胞底物或分子氧發(fā)生光化學反應，最終導致癌細胞死亡。在吸收了一個光子之后，PS從它的基態(tài)單重態(tài)(S0)轉(zhuǎn)移到激發(fā)單重態(tài)(Sn)。單激發(fā)態(tài)PS(singlet excited state PS)由于壽命很短(從納秒到皮秒)不能參與細胞底物的反應，為了回到基態(tài)，激發(fā)的PS要么以光的形式輻射能量，要么通過內(nèi)轉(zhuǎn)換(internal conversion，IC)釋放熱能而失去能量，從而返回S0，或者通過系統(tǒng)間交叉(inter-system crossing，ISC)將單激發(fā)態(tài)PS轉(zhuǎn)換為壽命更長(從毫秒到微秒)的激發(fā)三重態(tài)PS(triplet state PS)。三重態(tài)PS也通過發(fā)射熒光或熱而失去能量返回基態(tài)[7]。而在生物環(huán)境中，激發(fā)三重態(tài)主要通過以下兩種機制返回基態(tài)：一是電荷(即電子)轉(zhuǎn)移到周圍的基質(zhì)，導致形成超氧陰離子(O2·-)，接著蛻變?yōu)檫^氧化氫(H2O2)——高度活性羥基自由基(·HO)的前體，這是通過類Fenton反應形成的，即通過電子轉(zhuǎn)移直接與細胞基質(zhì)反應，最終生成氧化產(chǎn)物(Ⅰ型反應)；二是將能量(但不帶電荷)直接轉(zhuǎn)移到基態(tài)分子氧(3O2)中，從而產(chǎn)生高活性的單線態(tài)氧(1O2)(Ⅱ型反應)。1O2被認為是最具破壞性的ROS，因為它可以與蛋白質(zhì)的氨基酸、不飽和脂質(zhì)等多種生物分子反應。在這樣一個吸收和產(chǎn)生ROS的周期之后，PS再次處于基態(tài)，準備吸收一個新的光子來產(chǎn)生更多的ROS。因此，一個PS分子在被破壞之前可以產(chǎn)生數(shù)千個1O2分子。這兩種光動力機制的比率對于每個PS都是獨一無二的，取決于各自的化學結(jié)構(gòu)(圖1)[8]。

圖1 光動力療法的光化學和光物理機制(S0:基態(tài)單重態(tài)；Sn:激發(fā)單重態(tài)； T1: 激發(fā)三重態(tài)PS；A:光吸收；F:光輻射；H:熱能釋放(內(nèi)轉(zhuǎn)換)；ISC:系統(tǒng)間交叉；P:熒光發(fā)射；3O2:基態(tài)分子氧；1O2:單線態(tài)氧；O2·-:超氧陰離子；·HO:羥基自由基；H2O2:過氧化氫)[8]

PDT產(chǎn)生的ROS主要通過以下三種機制起抗腫瘤作用：①損傷病變部位的微血管，從而造成腫瘤或被感染的細胞缺血缺氧；②刺激機體免疫系統(tǒng)，增加炎癥及免疫介質(zhì)的釋放，提高對細胞的識別及殺傷效應；③通過凋亡、壞死途徑直接殺傷細胞[4]。隨著對PDT的深入研究，研究者們發(fā)現(xiàn)各種類型的細胞在被ROS氧化應激損傷后都可以引發(fā)自噬反應，而PDT在細胞中誘導的自噬有兩種結(jié)果，一方面可以維持細胞穩(wěn)態(tài)，保護細胞，另一方面，過度的自噬也可以引起自噬性細胞死亡(autophagic cell death，ACD)[5]。

2 細胞自噬現(xiàn)象

細胞自噬是一種高度保守的真核細胞分解代謝和再循環(huán)的過程。在能量或營養(yǎng)不足、代謝紊亂、缺氧等各種細胞應激情況下，細胞內(nèi)受損或無用的蛋白質(zhì)、細胞器或其他細胞質(zhì)成分被運輸?shù)饺苊阁w系統(tǒng)進行降解，產(chǎn)生氨基酸等降解產(chǎn)物供細胞重新利用，自噬在維持細胞新陳代謝、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及細胞器如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能中起著關鍵作用[9]。自噬水平一定程度上的增加有助于提高細胞的生存能力，對各種細胞毒性損傷做出反應。然而，自噬的過度激活也會造成不可逆損傷，加速細胞死亡，稱為ACD或Ⅱ型細胞程序性死亡(type Ⅱ programmed cell death，PCD)[9-10]。

在哺乳動物細胞中，自噬有三種主要類型:小自噬(microautophagy)、大自噬(macroautophagy)和伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。 雖然它們在形態(tài)學上各不相同，但三者最終都向溶酶體輸送“貨物”以進行降解和循環(huán)[11]。小自噬是一種非選擇性的細胞自噬，利用溶酶體膜的內(nèi)陷、突起或分隔直接捕獲溶酶體表面的細胞質(zhì)“貨物”或者完整的細胞器。CMA與小自噬的不同之處在于，它不使用膜結(jié)構(gòu)來隔離貨物，而是使用伴侶蛋白來選擇性識別底物蛋白，并以受體介導的方式一對一地跨溶酶體膜轉(zhuǎn)運底物。特別是含有特定五肽基序的底物被伴侶熱休克蛋白70(HSP 70)識別，該蛋白將蛋白質(zhì)底物傳遞到溶酶體膜表面，通過與溶酶體相關的受體膜蛋白2a (lamp-2a)相互作用，轉(zhuǎn)移到溶酶體腔內(nèi)迅速降解，CMA是唯一的一種選擇性細胞自噬形式。與小自噬和CMA不同，大自噬是在靶細胞內(nèi)合成雙膜囊泡(自噬體)，自噬體隔離受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)并與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autophagolysosome)，溶酶體水解酶隨后降解自噬體內(nèi)容物使其再參與循環(huán)利用。作為一種非特異性的整體降解過程，大自噬是三種細胞自噬類型中研究得最清楚的，也是PDT中常見的自噬類型[5, 10-11]。

細胞自噬是一個完整、動態(tài)、多步驟的過程，要準確、客觀地反映生物環(huán)境中的細胞自噬水平必須聯(lián)合應用多種檢測方法[12]。

首先，電子顯微鏡(electron microscopy，EM)被認為是細胞形態(tài)學方面檢測自噬水平最直接、經(jīng)典的方法[13]。自噬體是一種獨特的囊泡狀雙層膜結(jié)構(gòu)，包含有細胞質(zhì)，可能還有細胞器。自噬溶酶體僅具有單層膜結(jié)構(gòu)，可包裹處于不同降解階段含有致密電子的細胞質(zhì)和(或)細胞器[14]。Zhu等[15]在探討巖藻黃素在人胃癌SGC-7901細胞自噬中的作用時，用電子顯微鏡觀察到了不同階段的自噬體結(jié)構(gòu)。其次，質(zhì)粒熒光標簽檢測細胞自噬流。GFP-LC3、RFP-GFP-LC3熒光質(zhì)粒可分別通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光斑點、紅綠熒光信號變化及黃色熒光信號強度，檢測細胞自噬流，評價細胞自噬水平[16]。再次，Western-blotting檢測自噬標志性蛋白表達水平也是最常用的一種方法。除了LC3、ATG8是細胞自噬的經(jīng)典標志蛋白外，P62蛋白是目前研究最透徹的細胞自噬選擇性降解底物。一般情況下，P62蛋白水平的高低與細胞自噬的活性成反比，因此其表達量的變化也可用于監(jiān)測細胞自噬流[17]。

細胞自噬是一個發(fā)生、發(fā)展、變化的過程，在實驗中需根據(jù)自身研究的目的、內(nèi)容考慮使用多個不同的方法以準確地評估在給定的生物環(huán)境狀態(tài)下的細胞自噬程度。特別地，溶酶體不僅是細胞自噬過程中不可或缺的細胞器，也是一些光敏劑的靶點[17]。因此采用多種檢測方法來驗證細胞自噬，以此排除光敏劑可能帶來的影響是很有必要的。

3 PDT誘導細胞自噬

因為PDT誘導的細胞凋亡的發(fā)生較自噬更加快速且明顯，故以往科學家們更多地研究PDT引起的凋亡[18]。越來越多的研究表明，各種類型的細胞在PDT后都可以引發(fā)自噬反應。但是調(diào)節(jié)細胞自噬的分子機制尚不完全清楚，PDT后促進細胞生存還是死亡，也與PS類型、細胞類型、凋亡機制的存在與否和光損傷的程度有關[7]。

多種證據(jù)表明，PDT誘導的自噬可以減弱其對各種細胞的殺傷效應，如乳腺癌細胞(MDA-MB-231和 MCF-10A)、HeLa細胞和皮膚鱗狀細胞癌A431細胞[19-21]。乳腺癌細胞經(jīng)亞甲藍光動力療法(methylene blue photodynamic therapy，MB-PDT)處理后，細胞內(nèi)自噬體的形成和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值都明顯增加，使用自噬抑制劑后，MDA-MB-231和MCF-10A細胞死亡率增加，相反，自噬激活劑雷帕霉素可以進一步增強細胞自噬通量，減少PDT誘導的細胞死亡[19]。同樣，自噬抑制劑3-MA可通過抑制細胞自噬增強ALA-PDT對A431細胞產(chǎn)生的殺傷作用[21]。光敏蛋白光動力療法(photofrin-based photodynamic therapy)可誘導HeLa細胞產(chǎn)生強大的自噬作用，利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術在HeLa細胞系中敲除ATG5基因可以增強細胞的光敏感性，進而導致PDT介導的細胞毒性增加[20]。以上研究表明，細胞自噬可能作為光動力抵抗的一種機制存在。這也許可以解釋臨床上用光動力治療尖銳濕疣時,如果光敏劑用量不足常常會出現(xiàn)明顯的治療抵抗現(xiàn)象；同理也許可以解釋當光動力的其他治療參數(shù)(包括照射劑量、照射時間和光照距離等)不足時也會出現(xiàn)治療抵抗現(xiàn)象[22]。

細胞自噬水平的持續(xù)上調(diào)可以使PDT誘導的自噬反應從細胞保護作用向激活ACD轉(zhuǎn)變。Zhu等[23]的研究證實，甲基焦酚氯素光動力療法(methyl pyropheophenylchlorin-photodynamic therapy，MPPa-PDT)可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，ERS進一步通過PERK信號通路誘導細胞自噬，在體內(nèi)外對乳腺癌MDA-MB-231細胞均有殺傷作用。應用自噬抑制劑可以明顯減少自噬體的形成，同時降低PDT治療乳腺癌細胞的細胞毒性和凋亡。體外實驗中，甲基氨基酮戊酸光動力療法(methyl aminolevulinate photodynamic therapy，MAL-PDT)可以誘導DOK口腔癌前病變細胞發(fā)生ACD。同時體內(nèi)實驗表明，MAL-PDT抑制倉鼠頰囊腫瘤的生長。因此，MAL-PDT可能通過誘導ACD為口腔癌前病變提供一種有效的治療方法[24]。

細胞經(jīng)PDT處理后產(chǎn)生的反應與PDT劑量有關[10]。既往的研究揭示了金絲桃素介導的光動力療法(hypericin-mediated PDT，HY-PDT)可以增加結(jié)腸癌細胞對化療藥物——奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)的敏感性[25]。而進一步研究相關機制發(fā)現(xiàn)，HY-PDT誘導的不同程度的自噬對細胞命運和化療敏感性可以產(chǎn)生相反作用[26]。低劑量HY-PDT誘導保護性細胞自噬，促進細胞增殖，同時可降低L-OHP對奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細胞的細胞毒性。高劑量HY-PDT可以誘導大量ROS產(chǎn)生和嚴重的ERS，進而上調(diào)CHOP蛋白的表達和激活CHOP/TRIB3/Akt/mTOR級聯(lián)信號，觸發(fā)ACD[26]。綜上，細胞自噬程序激活的最終結(jié)果高度依賴于應激信號的強度和細胞內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)。

4 PDT中細胞自噬與凋亡的關系

在時間上，PDT誘導細胞自噬可以獨立甚至早于凋亡發(fā)生。經(jīng)過PDT處理后，人乳腺癌MCF7細胞系因缺失Caspase-3沒有發(fā)生典型的凋亡反應，但是凋亡缺陷的MCF-7v細胞中LC3-Ⅱ以時間和劑量依賴的方式大量積累，這表明細胞自噬可以單獨發(fā)生[27]。根據(jù)Kessel等[28]的研究結(jié)果，小鼠白血病L1210細胞暴露于LD90-PDT后，分別于15 min和60 min內(nèi)觀察到了細胞自噬和凋亡，前者可以首先發(fā)生。

PDT誘導的細胞自噬在凋亡活性細胞和凋亡缺陷細胞中可能發(fā)揮保護或者殺傷細胞兩種不同的作用。在凋亡活性細胞中，PDT引起的細胞自噬更傾向于起自我保護和抵抗光動力的作用。Valli等[29]探討了Pc13-PDT對人黑色素瘤A375細胞的光毒性作用，結(jié)果表明，阻斷PDT誘導的細胞自噬可以促進凋亡發(fā)生，增加PDT的殺傷效果，揭示了細胞自噬在其中的自我保護作用。此外，在重復接受Pc13-PDT處理的A375細胞中，檢測到對治療敏感性降低和細胞自噬激活增加，這表明細胞自噬可能是耐受PDT的機制之一[29]。在凋亡缺陷細胞中，細胞自噬主要引發(fā)ACD。在人前列腺Bax缺陷DU-145細胞中，PDT處理后只觀察到細胞自噬現(xiàn)象[30]。Panzarini等[31]研究結(jié)果顯示，醋酸玫瑰紅光動力療法(rose bengal acetate photodynamic therapy，RBAc-PDT)通過ROS和ERS激活HeLa細胞多條死亡信號通路，有趣的是，單獨抑制Caspase-9、Caspase-8、泛Caspases并不影響細胞自噬途徑的激活，引發(fā)ACD的發(fā)生。因此，PDT中細胞自噬的最終作用可能與凋亡機制有關。

5 結(jié)語

PDT通過產(chǎn)生的ROS(主要是1O2)損傷微血管、激活免疫系統(tǒng)，以凋亡、壞死途徑直接殺傷細胞，但PDT誘導的細胞自噬是一把雙刃劍，一定程度的自噬可以保護細胞，過度的自噬也可以引發(fā)ACD。在PDT中，由于光照時間、劑量、PS和細胞類型的不同以及是否引起凋亡，細胞自噬引發(fā)的結(jié)果也截然不同。在低劑量PDT處理和凋亡存在的細胞中，自噬可能是光動力抵抗的一種方式，更多地發(fā)揮細胞保護作用；在高劑量和凋亡缺陷的細胞中，自噬更多引發(fā)ACD。因此，臨床治療上應保證足夠的光動力效應(包括充分的光敏劑劑量、照射劑量、照射時間和光照距離等各種參數(shù))，以期充分利用細胞自噬途徑引起的殺傷效應，同時避免其產(chǎn)生的光動力抵抗效應，這提示，PDT聯(lián)合細胞自噬抑制劑在某些條件下可能是提高PDT療效的一種方法。