■ 陳昌福 周鑫軍（ 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)； 武漢科研時代生物技術(shù)有限公司）

本文報道采用2 種抗菌素藥物治療大口黑鱸（Micropterus salmoides）“潰瘍病”的效果觀察結(jié)果。從患病的大口黑鱸體內(nèi)分離病原菌菌株，在對其進行藥物敏感性測試的基礎(chǔ)上，分別按照鹽酸土霉素投喂量22mg/kg魚體重，鹽酸恩諾沙星按照15.5mg/kg魚體重的用藥量拌餌料投喂，每天投喂藥餌1次，連續(xù)投喂7d。與此同時，用二氧化氯制劑化水后在試驗池塘中全池潑灑，使養(yǎng)殖水體中的二氧化氯濃度達到0.30mg/L，隔天再潑灑1次，共潑灑2次。2種藥物的治療結(jié)果表明，采用抗菌素和二氧化氯結(jié)合應(yīng)用的藥物治療方法，對于大口黑鱸的“潰瘍病”顯示出了良好的治療效果。

大口黑鱸（Micropterus salmoides）在我國不少水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域的養(yǎng)殖量正在逐步增加，危害人工養(yǎng)殖大口黑鱸的“潰瘍病”（圖1）也日趨嚴(yán)重。為了尋找對大口黑鱸“潰瘍病”的有效治療方法，應(yīng)湖北省武漢市東西湖區(qū)走馬嶺養(yǎng)殖場大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)者的要求，從送檢的患有大口黑鱸“潰瘍病”的魚體內(nèi)分離菌株，并在針對分離菌株完成藥物敏感性測試的基礎(chǔ)上，參考各種抗菌素類藥物對從患病魚體內(nèi)分離到的致病菌株顯示出來的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），選擇合適的抗菌素類藥物對患病大口黑鱸進行了藥物治療。藥物治療獲得了良好的治療效果，特將其藥物治療過程和結(jié)果整理出來，供廣大的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者參考。

1 材料與方法

1.1 患病大口黑鱸的癥狀

2020年7月中旬，湖北省武漢市東西湖區(qū)走馬嶺養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的大口黑鱸發(fā)生了嚴(yán)重的疾病，每天均有大量的養(yǎng)殖大口黑鱸死亡。

患病魚的主要癥狀表現(xiàn)為，疾病發(fā)生初期魚群攝食量大幅度下降，病魚體表出現(xiàn)點狀或塊狀紅斑，隨后開始腐爛，尤其是腹部出現(xiàn)較多點狀和塊狀出血，鰭條偶爾也伴有“蛀鰭”的現(xiàn)象。

隨著病情的發(fā)展，體表出現(xiàn)潰瘍的癥狀逐漸明顯，腐爛的斑塊逐漸擴大，身體后半部分出現(xiàn)的潰瘍更為嚴(yán)重，少量魚體甚至尾鰭全部爛掉（圖2）。部分飼養(yǎng)池中飼養(yǎng)的大口黑鱸每天的死亡率達到3.0%～4.0%，個別飼養(yǎng)池的死亡率高達6.0%以上。

剖開患病魚的腹腔，可見大部分病魚的腸道內(nèi)都沒有食物，患病魚的肝臟顏色變淡，腎臟有稍微腫脹的現(xiàn)象。

1.2 致病菌株的分離

取已經(jīng)出現(xiàn)典型癥狀的患病魚體，在無菌條件下，從病魚的病灶處、肝臟和腎臟中采樣，在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHIA，Difco）平板上作劃線分離，培養(yǎng)48h后，從培養(yǎng)皿中挑取單個菌落進行純培養(yǎng)。用已經(jīng)純化培養(yǎng)的5個菌株（菌株編號分別為：DKHL001，DKHL002，DKHL003，DKHL004和DKHL005）做分離菌株的藥敏感性檢測。同時，分別將不同菌株轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 供試藥物

選用如下9種抗菌素標(biāo)準(zhǔn)品，完成了對從患病大口黑鱸體內(nèi)分離的5個菌株的藥物敏感性檢測。這9種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品分別是，氨芐西林鈉（Ampicillin，Amresco，批號：200218），鹽酸恩諾沙星（Enrofloxacin，Amresco，批號：200114），鹽酸土霉素（Oxytetracycline，Amresco，批號：200124），硫酸新霉素（Neomycinsulphate，Amresco，批號：200322），強力霉素（Hydramycin，Amresco，批號：200105），甲砜霉素（Thiamphenicol，Amresco，批號：200215），氟苯尼考（Florfenicol，Amresco，批號：000507），硫氰酸紅霉素（Erythromycin thiocyanate，Difco，批號：200216），磺胺間甲氧嘧啶（Sodium sulfamonomethoxine，Difco，批號：000415）等9種抗菌素藥物用于對分離菌的藥物敏感性試驗。

1.4 最小抑菌濃度（MIC）的測定

依日本化學(xué)療法學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)法進行。首先將供試藥物用適宜的容媒預(yù)溶后，滅菌生理鹽水分別稀釋至1,000～0.25mL/L的2倍稀釋的系列藥物濃度。然后用FWA培養(yǎng)基將各濃度的藥物液稀釋10倍，從而使各試管內(nèi)培養(yǎng)基中的各種藥物的濃度達到100～0.025mL/L的2倍稀釋的系列藥物濃度。最后向每支盛有3.0mL培養(yǎng)基的試管中加入0.10mL濃度為1.0×106cfu/mL活菌液，將接種菌種后的試管置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，經(jīng)肉眼觀察證實無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.5 最小殺菌濃度（MBC）的測定

從各MIC濃度或者高于2～4倍MIC濃度的試管中分別吸取0.1mL培養(yǎng)基，接種于腦心浸液瓊脂（BHIA，Difco）平皿中，在25℃條件下培養(yǎng)48h，無菌落出現(xiàn)的相應(yīng)試管中的最低藥物濃度，即為最小殺菌濃度（MBC）。

1.6 治療用藥物的選擇及使用方法

根據(jù)對分離菌株進行的藥物敏感性試驗結(jié)果，選擇鹽酸土霉素和鹽酸恩諾沙星作為拌餌口服藥物，以抑制或者殺滅病魚體內(nèi)的致病菌。在投喂口服抗菌素類藥物的同時，采用二氧化氯（ClO2，河南省新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號為200302，含量為6.6%）作為外用藥物，采取全池潑灑法用藥，以控制養(yǎng)殖池水中的致病菌。

選擇發(fā)病狀況相同，池塘條件相似的4個飼養(yǎng)池進行2種抗菌素藥物治療試驗。根據(jù)養(yǎng)殖池塘內(nèi)養(yǎng)殖大口黑鱸的數(shù)量，計算出每個養(yǎng)殖池塘內(nèi)藥物用量后，首先將鹽酸土霉素和鹽酸恩諾沙星分別混合在面粉糊中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅▓D3、圖4），再潑灑在顆粒飼料上混合均勻，在陰涼處晾干后投喂。

按照藥物敏感性檢測結(jié)果，確定鹽酸土霉素的投喂量為22mg/kg魚體重，將制備的藥物餌料投喂Ⅰ號和Ⅱ號池塘，確定鹽酸恩諾沙星的投喂量為15.5mg/kg魚體重，將制備的藥物餌料投喂Ⅲ號和Ⅳ號池塘。每天投喂藥物餌料1次，連喂7d為1個療程。在相鄰的Ⅴ號池塘不投喂藥物餌料，作為本次試驗的對照池塘。

在投喂藥物餌料的第1d，在試驗池塘中潑灑ClO2，臨用前剪開ClO2的包裝袋，并準(zhǔn)確稱取所需量，用適量水將ClO2溶解后，在試驗池塘內(nèi)全池潑灑，使飼養(yǎng)池水中的ClO2濃度達到0.30mg/L，間隔1d后再潑灑1次，連續(xù)潑灑2次。

1.7 療效判定

當(dāng)用藥開始后，每天統(tǒng)計各個飼養(yǎng)池中的死亡大口黑鱸的數(shù)量，直到最后1次用藥結(jié)束后的第7d為止。根據(jù)各個飼養(yǎng)池中死亡大口黑鱸數(shù)量，依下式計算藥物的有效率。

參照用藥后的有效率，對藥物防治細(xì)菌病的效果進行評價。此外，對試驗過程中死亡大口黑鱸進行病理學(xué)解剖診斷，判斷其引起死亡的原因。

2 結(jié)果

2.1 MIC

表1 各種抗抗菌素類藥物對分離菌株的最小抑菌濃度

表2 各種抗菌素類藥物對分離菌株的最小殺菌濃度

表3 投喂不同藥物制備藥物餌料對患病大口黑鱸的治療效果

各種抗菌藥物在試管內(nèi)對從患病魚體內(nèi)分離的5個菌株的MIC測定結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，在9種供試藥物中，以鹽酸恩諾沙星和鹽酸土霉素的抑菌活性最強，其他幾種藥物的抑菌效果均相對較差。

2.2 MBC

各種抗菌素藥物在試管內(nèi)對從患病魚體內(nèi)分離的5個致病菌株的MBC測定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，在9種供試藥物中，除磺胺間甲氧嘧啶的MBC高于100mg/L外，其他抗菌藥物的的MBC均大多在50mg/L以內(nèi)，鹽酸恩諾沙星的殺菌效果最好，為MBC為6.25mg/L，其次是鹽酸土霉素，其MBC為6.25～12.5mg/L。

2.3 藥物治療效果

選擇對分離菌株具有較好抑菌和殺菌效果的鹽酸恩諾沙星和鹽酸土霉素作為本試驗的治療藥物。在不同的供試池塘投喂給藥后，對大口黑鱸的藥物治療效果如表3所示。由表3可以看出，與未用藥物的Ⅴ號對照池塘中的死亡率相比，從用藥后的第2d開始，大口黑鱸的死亡率即開始大幅度下降，連續(xù)用藥7d后，就幾乎停止了死亡。而未用藥的對照組中的大口黑鱸則始終出現(xiàn)了較高的死亡率。采用鹽酸恩諾沙星+二氧化氯的2個試驗試驗池塘中的藥物治療有效率分別達到37.3%和29.9%，而采用鹽酸土霉素+二氧化氯的2個試驗試驗池塘中的藥物治療有效率分別達到37.1%和36.4%。

3 討論

關(guān)于引起大口黑鱸“潰瘍病”的致病菌，我們雖然從患病大口黑鱸體內(nèi)分離到了5個菌株，但是，我們尚未對分離菌株完成種類鑒定。不過，根據(jù)對分離菌株完成的藥物敏感性試驗結(jié)果，選擇對分離菌株具有良好抑制和殺菌效果的2種抗菌類藥物，拌和在大口黑鱸的餌料中連續(xù)投喂7d，均有效地控制住了大口黑鱸“潰瘍病”的蔓延。所以，藥物治療疾病的結(jié)果間接地證明了引起大口黑鱸“潰瘍病”的病原可能是某種致病細(xì)菌。

由細(xì)菌性病原引起的水產(chǎn)動物疾病，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者除了可以采用細(xì)菌性疫苗提前預(yù)防外，一旦疾病發(fā)生后，大都只能依靠采用各種抗菌藥物進行治療。但是，如果使用者對抗菌類藥物的選擇或者使用不當(dāng)，如用藥劑量不足或者沒有按照藥物適應(yīng)癥用藥，以及隨意混用各種抗菌素類藥物的話，不僅難以獲得理想的藥物治療效果，還可能會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性。本研究采取從患病魚體中分離菌株，在完成藥物敏感性試驗后，選擇對分離菌株具有良好抑制和殺滅效果的藥物用于治療疾病，有效地避免了上述現(xiàn)象的發(fā)生。