鄭新龍 鄭素雅 林 根

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州 350122；2.福州市第二醫(yī)院，福建福州 350007；3.福建省腫瘤醫(yī)院，福建福州 350014）

中醫(yī)認(rèn)為肺熱傷津，氣化失宣可引起尿路疾病。采取黃芪-南沙參-北沙參（HNB）配伍氣陰雙補(bǔ)扶正抗癌，郁仁存等教授基于辨證后使用HNB配伍治療尿路上皮癌（包括膀胱癌）取得顯著療效[1-2]。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的發(fā)展，大量基礎(chǔ)研究在分子層面揭示中藥抗癌的機(jī)理，特別是通過(guò)免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)扶正中藥都有不同程度的免疫促進(jìn)作用[3]，這極大地支持中醫(yī)“扶正驅(qū)邪”的抗癌理念。中藥具有廣泛的生物學(xué)作用，已有證據(jù)表明其可能與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境及癌細(xì)胞的協(xié)同作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫力有關(guān)[4-5]。本研究探索性研究HNB結(jié)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑提高尿路上皮癌患者臨床獲益可能的潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 中藥有效成分篩選及靶基因獲取

從傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中鑒定黃芪，南、北沙參（HNB）的化學(xué)成分[6]，根據(jù)口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性（DL）＞0.18 進(jìn)行篩選[7]，得到HNB活性成分。選擇相關(guān)靶點(diǎn)（Related Targets）獲取HNB所有活性成分對(duì)應(yīng)的靶基因。

1.2 獲取IMvigor210隊(duì)列患者的差異基因（DEG）

大 型2期 試 驗(yàn)（IMvigor210）研 究PD-L1抑 制劑（atezolizumab）對(duì)轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌的臨床活性（n=348）。使用Creative Commons 3.0許可證獲取完整軟件的文檔和數(shù)據(jù)包，從http：//research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies下載。R包limma[8]被用來(lái)識(shí)別差異基因，P＜0.05和| log 2（fold change）|＞0.5的基因被認(rèn)為是顯著差異表達(dá)并和尿路上皮癌免疫治療療效差異相關(guān)的基因[9]。

1.3 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)

將具有免疫治療療效差異的基因與篩選出的NBS（黃芪、南沙參、北沙參）活性成分對(duì)應(yīng)的靶基因映射，建立活性成分與靶基因?qū)?yīng)關(guān)系，得到活性成分以及關(guān)鍵靶基因。使用Cytoscape軟件（Version 3.7.0）構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。使用string在線工具構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用注釋、可視化和集成研究數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能進(jìn)行GO分析（DAVID，https ：//david.ncifcrf.gov，v6.8）。對(duì)基因功能類別富集分析（FDR 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率＜0.05）并選擇前20個(gè)GO功能類別。KEGG分析FDR＜0.05認(rèn)為通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選擇具有顯著途徑調(diào)節(jié)的基因用于基因途徑網(wǎng)絡(luò)分析。構(gòu)建通路網(wǎng)絡(luò)以篩選HNB結(jié)合免疫治療的關(guān)鍵靶基因。

2 結(jié)果

2.1 黃芪，南、北沙參活性成分和靶基因

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定的化學(xué)成分（表1），分別篩出 9 個(gè)北沙參、 4 個(gè)南沙參和17個(gè)黃芪活性成分。

2.2 鑒定與免疫治療療效差異相關(guān)的基因

對(duì)尿路上皮癌細(xì)胞進(jìn)行免疫治療后電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，分化明顯的為具有治療效果，未分化為無(wú)效，確定818個(gè)組間差異基因。火山圖表示差異表達(dá)基因的分布，如圖1，其中482個(gè)基因下調(diào)，336個(gè)基因上調(diào)。注：橫坐標(biāo)代表基因表達(dá)的倍數(shù)變化，縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)顯著性；右邊（上調(diào)）和左邊（下調(diào)）表示明顯差異表達(dá)的基因。

2.3 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)

表1 黃芪，南、北沙參活性成分表

選取中藥靶基因和差異基因的交集基因并構(gòu)建“中藥-活性成分-基因”網(wǎng)絡(luò)圖。發(fā)現(xiàn)MOL000098（槲皮素，quercetin）基因最多（n=15），其次，MOL000378（黃芪異黃烷苷，7-O-methylisomucronulatol）和MOL000392（芒柄花黃素，formononetin）均作用在7個(gè)靶基因上。

2.4 確定HNB結(jié)合免疫治療的核心靶點(diǎn)

將HNB潛在靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)和免疫治療療效差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)合并，該網(wǎng)絡(luò)由853個(gè)節(jié)點(diǎn)和17841個(gè)邊組成（圖2-A），大于中位DC的節(jié)點(diǎn)核心候選靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)[10]，包含417個(gè)節(jié)點(diǎn)和11117個(gè)邊（圖2-B）。BC值為500鑒定出75個(gè)靶基因，包含75個(gè)節(jié)點(diǎn)和1128個(gè)邊（圖2-C）。前5個(gè)基因分別為：TP53、AKT1、EP300、MDM2和CCND1，與其他相互作用的基因數(shù)目為分別為：66、53、51、50和49。

2.5 GO 功能富集分析

基于GO分析靶基因的生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF），根據(jù)校正后 P 值進(jìn)行排序。生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞成分和分子功能方面包括有絲分裂細(xì)胞周期相變的調(diào)控、DNA代謝過(guò)程的調(diào)控、蛋白質(zhì)去泛素化、p53類介體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、DNA損傷檢查點(diǎn)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、先天免疫應(yīng)答激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖等。

2.6 KEGG 通路富集分析

KEGG分析共富集 124條通路（FDR ＜0.05）（圖 3）。黃芪，南、北沙參干預(yù)免疫治療患者的信號(hào)通路包括細(xì)胞周期、膀胱癌、FoxO信號(hào)通路、癌癥中的MicroRNA、乳腺癌、PI3K-Akt（磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、TGF-beta信號(hào)通路、Th17（輔助性T細(xì)胞17）細(xì)胞分化、癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)途徑、癌癥中的中央碳代謝等。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索扶正中藥聯(lián)合免疫抑制劑有益于尿路上皮癌患者的潛在可能機(jī)制。KEGG富集分析的TGF-beta信號(hào)通路和免疫治療抑制顯著相關(guān)；B細(xì)胞受體信號(hào)通路及T細(xì)胞受體信號(hào)通路的激活和免疫促進(jìn)相關(guān)。此外，癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)途徑和本研究相關(guān)度極高。采用生物信息學(xué)方法檢索 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于 FoxO3 在膀胱癌患者癌組織和正常膀胱組織中的表達(dá)水平并進(jìn)行比較，結(jié)果提示 FoxO3 在膀胱癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，而這種下調(diào)水平在不同分期的膀胱癌組織中是一致的，說(shuō)明 FoxO3 下調(diào)是膀胱癌早期事件，且不隨疾病的進(jìn)展而改變。因此有必要進(jìn)一步確認(rèn)核心基因的免疫治療作用。綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過(guò)構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，從多成分、多靶點(diǎn)、多通路闡釋人黃芪，南、北沙參和免疫治療結(jié)合抗癌的潛在機(jī)制?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到的活性成分與靶基因具有相關(guān)性，但不能明確活性成分對(duì)靶基因調(diào)控關(guān)系。一部分中藥活性成分與靶基因相互作用是通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬得出，仍有待驗(yàn)證。