陳星星，雷曉燕，孫永紅，胡筱霞，趙淑珍

(甘肅省人民醫(yī)院 兒科，甘肅 蘭州 730000)

神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(neuronal ceroid lipofuscinoses, NCLs)是一組遺傳異質(zhì)性溶酶體貯積病，主要表現(xiàn)包括多種類型的癲癇發(fā)作、肌陣攣、智力運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后或倒退以及視力損害[1]。主要病因?yàn)槿苊阁w蛋白酶的基因缺陷及結(jié)構(gòu)蛋白的功能失調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)脂褐素沉積[1-2]。目前報(bào)道的發(fā)病率為(0.1～7.0)/10 萬(wàn)，不同地區(qū)會(huì)有差異[3]，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。NCLs最初根據(jù)發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)以及電鏡下沉積物特征在臨床上可分為嬰兒(Haltia-Santavuori)、晚期嬰兒(Jansky-Bielschowsky)、青少年(Batten，Spielmeyer-Vogt)和成人(Kufs)共4種亞型，而現(xiàn)今根據(jù)基因型，NCLs可分為CLN1～CLN14共14種亞型，其中CLN2和CLN3型較為常見(jiàn)[1-4]。

不同亞型的NCLs疾病根據(jù)發(fā)病年齡不同可有不同表現(xiàn)[1, 4-5]，其中CLN2為經(jīng)典的晚期嬰兒型：2～4歲間發(fā)病，始發(fā)通常為癲癇發(fā)作和(或)共濟(jì)失調(diào)，隨后可出現(xiàn)獲得性里程碑式發(fā)育落后，難治性癲癇，共濟(jì)失調(diào)或進(jìn)一步惡化，以及錐體征束表現(xiàn)。發(fā)作可表現(xiàn)為各種類型的肌陣攣發(fā)作、非典型失神發(fā)作、強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。視覺(jué)障礙通常出現(xiàn)在4～6歲，并且進(jìn)展迅速，最終視力喪失，大多數(shù)CLN2確診患者在臥床不起和失明后過(guò)早死亡，預(yù)期壽命從6歲到十幾歲。CLN2型疾病為常染色體隱性遺傳疾病，由TPP1基因突變所致，此基因編碼蛋白為三肽基肽酶，其可從蛋白質(zhì)的N末端順序去除三肽[5]。該報(bào)道對(duì)一例結(jié)合臨床表型、全外顯子組測(cè)序技術(shù)(whole exome sequencing, WES)診斷的CLN2進(jìn)行討論和研究，通過(guò)相關(guān)基因診斷技術(shù)和遺傳學(xué)分析對(duì)這類臨床表型隱匿，分型復(fù)雜的疾病進(jìn)行再次認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1病歷摘要 患兒，男，4歲，主因“診斷癲癇20月，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙伴語(yǔ)言發(fā)育倒退8個(gè)月”于2018-12-23入院。3歲1個(gè)月時(shí)出現(xiàn)間斷抽搐，4歲1個(gè)月開(kāi)始出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言倒退、肢體抖動(dòng)，5歲開(kāi)始出現(xiàn)肢體抖動(dòng)加重、視力下降、雙眼感光消失、失語(yǔ)、癱瘓?jiān)诖病?/p>

1.2研究方法

1.2.1臨床診斷與家系分析 收集患者家族史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查等臨床資料。

1.2.2樣本采集與測(cè)序?qū)嶒?yàn) 在患者及其父母知情同意的情況下，采取患者及其父母的外周血樣本，使用血液基因組提取試劑盒(UnigeneDx)進(jìn)行DNA提取，并用Life Technologies 公司生產(chǎn)的Qubit測(cè)定DNA的濃度進(jìn)行定量。參照KAPA HyperPlus(KAPA Biosystem, Roche)文庫(kù)準(zhǔn)備試劑盒及SeqCapEZ捕獲試劑盒(NimbleGen, Roche)對(duì)基因組DNA進(jìn)行片段化、末端修復(fù)、接頭連接及雜合捕獲，制備外顯子捕獲文庫(kù)。文庫(kù)采用HiSeq X Ten (Illumina)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。該研究獲得甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)。

1.2.3數(shù)據(jù)分析及驗(yàn)證 采用FASTQC(v0.11.5)對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，通過(guò)BWA軟件(v0.7.15)[6]工具將測(cè)序得到的.fastq文件比對(duì)到參考基因組上(基因組版本為hg19)，利用Samtools(v1.3.1)、Picard、GATK等工具對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化、排序、去重、重排以及堿基質(zhì)量矯正，利用Annovar工具對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行注釋[7-8]。最后根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)(ACMG)分類指南并結(jié)合患者癲癇的臨床表型進(jìn)行相關(guān)變異的篩選[9]。變異分析過(guò)程中參考公共人群頻率數(shù)據(jù)庫(kù)(ExAC、ESP、1000Genomes及gnomAD)與dbSNP、OMIM、HGMD、ClinVar等多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行變異的致病性評(píng)估。根據(jù)分析所得的候選變異位點(diǎn)，在NCBI網(wǎng)站下載TPP1序列并設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物，對(duì)患者及其妹妹和父母的DNA 樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過(guò)Sanger測(cè)序進(jìn)行序列的比對(duì)驗(yàn)證。

1.2.4突變致病性預(yù)測(cè)與蛋白序列同源性比對(duì) 利用蛋白功能預(yù)測(cè)軟件(SIFT、Polyphen2及MutationTaster)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)所得變異的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)Uniport及Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)查找并下載人及其他物種的TPP1蛋白序列，使用Jalview軟件進(jìn)行蛋白同源序列比對(duì)[10]。

2 結(jié) 果

2.1臨床診斷與家系分析 患兒出生時(shí)視力正常，3歲1個(gè)月時(shí)出現(xiàn)間斷抽搐，曾就診于某三甲醫(yī)院，完善腦電圖、頭顱MRI等相關(guān)檢查后確診為癲癇，給予丙戊酸鈉口服治療，患兒抽搐有所好轉(zhuǎn)。于4歲1個(gè)月時(shí)家長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)患兒運(yùn)動(dòng)逐漸倒退，具體表現(xiàn)為不能獨(dú)自行走，走路不穩(wěn)，正常行走不超過(guò)20 min，伴四肢不自主抖動(dòng)，出現(xiàn)語(yǔ)言發(fā)育倒退，只能叫“媽媽”，且吐字不清，考慮運(yùn)動(dòng)障礙性腦病，且8個(gè)月來(lái)上述癥狀進(jìn)行加重。入院體格檢查：意識(shí)清楚，精神尚可，呼吸平穩(wěn)，面色尚可，無(wú)特殊面容，構(gòu)音不清，言語(yǔ)笨拙，雙瞳孔等大、正圓，直徑約3 mm，對(duì)光反應(yīng)靈敏，眼球運(yùn)動(dòng)充分，未見(jiàn)眼球震顫，頸軟無(wú)抵抗感，心肺腹查體未見(jiàn)陽(yáng)性體征，四肢及關(guān)節(jié)無(wú)畸形，雙下肢肌力Ⅳ級(jí)，肌張力正常，走路不穩(wěn)，伴軀干及四肢不自主抖動(dòng)，雙下肢無(wú)水腫，神經(jīng)系統(tǒng)查體雙巴氏征陰性；雙膝腱反射、跟腱反射、輪替試驗(yàn)、指鼻試驗(yàn)、跟膝脛等試驗(yàn)不能配合檢查。輔助檢查：血常規(guī)、生化全套、血乳酸、血氨、同型半胱氨酸、銅藍(lán)蛋白、尿常規(guī)均正常。丙戊酸鈉血藥濃度在正常范圍。頸部血管超聲：雙側(cè)頸動(dòng)脈、頸靜脈超聲未見(jiàn)明顯異常。動(dòng)態(tài)視頻腦電圖示：異常幼兒腦電圖(背景活動(dòng)偏慢，睡眠期雙側(cè)額、顳區(qū)為主多灶性棘波、棘慢波、尖波及慢波發(fā)放)。顱腦MRI示：雙側(cè)大、小腦半球腦萎縮改變，請(qǐng)結(jié)合臨床；右側(cè)上黏膜增厚(圖1)。患兒于4歲11月時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)視力下降，視物不清，視野逐漸減小，至5歲時(shí)，雙眼感光完全消失，肢體不自主抖動(dòng)加重，四肢無(wú)力，癱瘓?jiān)诖?，伴失語(yǔ)。該患者的發(fā)病年齡在4歲左右，視力進(jìn)行性減退，臨床癥狀以癲癇，運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言倒退伴視力喪失為主。

圖1 雙側(cè)大、小腦半球腦萎縮改變

患者父母均未出現(xiàn)類似癥狀，家族中未出現(xiàn)類似病史。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、動(dòng)態(tài)視頻腦電圖、頭顱MRI、基因檢測(cè)等相關(guān)檢查，診斷 JNCL，CLN2 型(晚嬰型)。

2.2全外顯子組測(cè)序與 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證 本次在受檢者TPP1 基因上檢出兩個(gè)突變位點(diǎn)：已報(bào)道的致病位點(diǎn)c.1424C>T(p.Ser475Leu)和 新發(fā)突變位點(diǎn)c.962A>G(p.His321Arg) 。患者父親樣本檢出 TPP1基因上c.1424C>T(p.Ser475Leu)(圖2)雜合變異；患者母親樣本檢出TPP1基因上c.962A>G(p.His321Arg)雜合變異(圖3)。一代測(cè)序證實(shí)，先證者的c.1424C>T 變異遺傳自父親，c.962A>G 變異遺傳自母親，這兩變異在染色體上為反式排列。TPP1基因突變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥2型，遵循常染色體隱性遺傳。并對(duì)以上2個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證，證明確實(shí)存在。

圖2 TPP1 c.1424 位點(diǎn)Sanger測(cè)序圖 TPP1基因c.1424C>T(p.Ser475Leu) 突變遺傳來(lái)自父親。 a.患者TPP1基因上檢測(cè)到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變；b.患者父親TPP1基因上檢測(cè)到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變; c.患者母親TPP1基因上未檢測(cè)到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變

圖3 TPP1 c. 962位點(diǎn)Sanger測(cè)序圖 TPP1基因c.962A>G(p.His321Arg) 突變遺傳來(lái)自母親。a患者 TPP1基因上檢測(cè)到 c.962A>G(p.His321Arg)突變；b患者父親TPP1基因上未檢測(cè)到c.1424C>T(p.Ser475Leu)突變；c患者母親TPP1基因上檢測(cè)到 c.962A>G(p.His321Arg) 突變

2.3突變致病性預(yù)測(cè)分析 突變位點(diǎn)1 c.1424C>T(p.Ser475Leu)：①表示TPP1基因CDS區(qū)的第1424號(hào)核苷酸由C突變?yōu)門，導(dǎo)致編碼的第475號(hào)氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榱涟彼幔虎诖俗儺愒谄胀ㄈ巳褐械淖畲髷y帶頻率為0.039%，提示變異在普通人群中罕見(jiàn)(PM2);③ 此變異位于肽酶 S8/S53 功能結(jié)構(gòu)域(PM1); ④ 此變異與已報(bào)道的另一致病變異 c.509-1G>C曾在CLN2患者中有檢出，兩者在染色體上為反式排列[11](PM3);⑤ 多個(gè)軟件(SIFT，MutationTaster，PolyPhen2)預(yù)測(cè)此變異有害(PP3)； ⑥此變異在 Clinvar 和 LOVD 數(shù)據(jù)庫(kù)中有多次提交記錄，其中至少有 2 例為疑似致病變異記錄； ⑦ 一代測(cè)序證實(shí)，先證者的父親也攜帶有此變異，先證者的母親和妹妹均未攜帶此變異，證實(shí)先證者的此變異遺傳自父親；⑧TPP1 基因編碼三肽基肽酶，其突變會(huì)導(dǎo)致CLN2，遵循常染色體隱性遺傳；⑨該例受檢者表型與 CLN2 疾病部分符合。根據(jù)ACMG指南(PM2+PM1+PM3+PP3)，暫將 c.1424C>T(p.Ser475Leu)變異判為疑似致病變異。

突變位點(diǎn)2 c.962A>G(p.His321Arg)：①此變異表示 TPP1 基因 CDS 區(qū)域的第 962 號(hào)核苷酸由 A 突變?yōu)?G，導(dǎo)致編碼的第 321 號(hào)氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼?；②此變異在多個(gè)普通人群數(shù)據(jù)庫(kù)(1000g、ExAC 及 gnomAD)中未見(jiàn)報(bào)道，提示變異在普通人群數(shù)據(jù)庫(kù)中極為罕見(jiàn)(PM2)；③多個(gè)軟件(SIFT，MutationTaster，PolyPhen2)預(yù)測(cè)此變異有害(PP3)；④此變異位于肽酶 S8/S53 功能結(jié)構(gòu)域(PM1)；⑤暫未發(fā)現(xiàn)此變異存在相關(guān)臨床或功能報(bào)道。一代測(cè)序結(jié)果顯示，先證者的母親攜帶有此變異，父親未攜帶，證實(shí)先證者的此變異遺傳自母親。此變異與本次檢出的另一疑似致病變異(c.1424C>T)在染色體上為反式排列，符合 CLN2 疾病的常染色體隱性遺傳模式。綜上，根據(jù) ACMG 指南(PM2+PM1+PP3+PM3)，暫將 c.962A>G(p.His321Arg)變異歸為疑似致病變異。

2.4蛋白序列同源性比對(duì) 以上兩個(gè)突變位點(diǎn)，在人類和其他物種同源蛋白相同區(qū)域高度保守不易發(fā)生改變，TPP1表達(dá)蛋白第 475 位氨基酸基本為 Ser，第 321 位氨基酸基本為His(圖4)。

圖4 TPP1 c.1424C>T(p.Ser475Leu)和TPP1 c.962A>G(p.His321 Arg) 蛋白序列同源性比對(duì) a.TPP1 c.1424C>T(p.Ser475Leu)蛋白同源性比對(duì)(紅色框標(biāo)注的為變異位點(diǎn)，結(jié)果顯示此位點(diǎn)在多個(gè)物種中保守)；b.TPP1 c.962A>G(p.His321 Arg)蛋白同源性比對(duì)(紅色框標(biāo)注的為變異位點(diǎn)，結(jié)果顯示此位點(diǎn)在多個(gè)物種中保守)

3 討 論

NCLs是一組遺傳異質(zhì)性溶酶體貯積病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，診斷主要通過(guò)臨床表現(xiàn)、病理、腦電圖、 影像學(xué)及分子生物學(xué)確診，由于診療水平有限，該病極易誤診。文中受檢者單憑基因檢測(cè)結(jié)果不能確診，但綜合臨床表現(xiàn)(與CLN2部分符合)、頭顱MRI結(jié)果、腦電圖資料及基因檢測(cè)結(jié)果最終診斷為CLN2?，F(xiàn)根據(jù)基因型可分為CLN1～CLN14共14種亞型，其中CLN2疾病為經(jīng)典的晚期嬰兒型[1]。

CLN2遵循常染色體隱性遺傳，可由TPP1/CLN2突變導(dǎo)致其編碼的三肽基肽酶失活而引起CLN2的一系列臨床表現(xiàn)[5, 12]，該病尚無(wú)特效治療方法。國(guó)內(nèi)報(bào)道的NCLs患者突變基因主要是 CLN1、CLN2、CLN3、CLN5、CLN6、CLN7，臨床多表現(xiàn)為難治性癲癇、視力下降、智力下降、精神及運(yùn)動(dòng)功能障礙、性格行為改變、記憶力下降，且在中國(guó)人群NCLs病例報(bào)道中，嬰兒型(INCLs)13例(12.9%)，晚期嬰兒型(LINCLs)48 例(47.5%)，青少年型(Batten 型，JNCLs) 30例(29.7%)，成年型(ANCLs)10例(9.9%)；其中僅32例完善了基因檢測(cè)[13]。

由于大多數(shù) CLN2 確診患者在臥床不起和(或)失明后過(guò)早死亡，然而，不可逆的神經(jīng)退行性變通常發(fā)生在5歲確診之前[14]，最近批準(zhǔn)的腦室內(nèi)酶替代療法已被證明可以有效減緩CLN2疾病患者運(yùn)動(dòng)和語(yǔ)言功能的快速下降[15]，因此早期診斷對(duì)優(yōu)化護(hù)理、改善患者生活質(zhì)量就顯得更加重要。但是在我國(guó)，由于對(duì)該疾病認(rèn)識(shí)低、臨床表現(xiàn)不明確以及診斷檢測(cè)的可及性有限，診斷延遲是常見(jiàn)的。但是在診斷方面，除了基因檢測(cè)，還有頭顱MRI、腦電圖均可提示CLN2疾病的診斷，例如，嚴(yán)重的小腦萎縮是MRI診斷時(shí)的主要表現(xiàn)[16]，腦電圖檢測(cè)到的光敏性也是CLN2疾病的早期標(biāo)志[17]。

CLN2的主要病因?yàn)門PP1/CLN2基因突變引起溶酶體蛋白酶的基因缺陷及結(jié)構(gòu)蛋白的功能失調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)脂褐素沉積[5]。目前已報(bào)道了的TPP1超過(guò) 100 種突變，包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、剪接變異、插入缺失等，突變分布整個(gè)編碼區(qū)[12]，但是目前TPP1在體內(nèi)的底物尚不清楚，TPP1酶缺乏癥的分子、病理機(jī)制尚不清楚[18-20]。TPP1/CLN2基因位于11p15染色體上[21]，包含13個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為6.7 kb，編碼溶酶體外肽酶(TPP1)，酸化后以無(wú)活性的原酶形式被加工成一個(gè)46 000的蛋白質(zhì)。成熟的酶從溶酶體降解的小多肽的氨基末端裂解三肽，并且具有弱的內(nèi)肽酶活性[22]。

迄今為止，在389名TPP1缺乏癥患者中報(bào)告了131個(gè)TPP1基因變異，在CLN2疾病中，大多數(shù)患者(60%)有兩種常見(jiàn)的變異之一(c.509-1 G>C和C.622 C>T[p.(Arg208*)])，這兩個(gè)變異使密碼子過(guò)早終止，一直被報(bào)道有致病性[13]。如果患者有任何CLN2疾病的跡象，并且分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TPP1中有任何致病或可能致病的變異，TPP1酶活性檢測(cè)可用于確診[5]。但是，在本例報(bào)道中由于實(shí)驗(yàn)條件所限，尚未進(jìn)行TPP1酶活性的檢測(cè)，這是本文的不足之處。

CLN2為常染色體隱性遺傳，即等位基因上有2個(gè)有害突變可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。 本文檢測(cè)到的TPP1: c.1424C>T(p.Ser475Leu)和c.962A>G(p.His321Arg) 在正常人群中發(fā)生概率極低。 TPP1 基因 CDS 區(qū)的第 1424 號(hào)核苷酸由 C 突變?yōu)?T，導(dǎo)致編碼的第 475 號(hào)氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榱涟彼?，此變異與已報(bào)道的另一致病變異 c.509-1G>C 曾在CLN2患者中有檢出，兩者在染色體上為反式排列[11]。此外，另一個(gè)突變位點(diǎn)c.962A>G(p.His321Arg)，提示TPP1 基因 CDS 區(qū)域的第 962 號(hào)核苷酸由 A 突變?yōu)?G，導(dǎo)致編碼的第 321 號(hào)氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼?，此變異在多個(gè)普通人群數(shù)據(jù)庫(kù)(1000g、ExAC 及 gnomAD)中未見(jiàn)報(bào)道，提示變異在普通人群數(shù)據(jù)庫(kù)中極為罕見(jiàn)；此變異位于肽酶 S8/S53 功能結(jié)構(gòu)域，表明該突變位點(diǎn)對(duì)TPP1蛋白的正常功能至關(guān)重要，目前暫未發(fā)現(xiàn)此變異存在相關(guān)臨床或功能報(bào)道。一代測(cè)序結(jié)果顯示，先證者的母親攜帶有此變異，父親未攜帶，證實(shí)先證者的此變異遺傳自母親。此變異與本次檢出的另一疑似致病變異(c.1424C>T)在染色體上為反式排列，符合 CLN2 疾病的常染色體隱性遺傳模式。以上兩個(gè)突變位點(diǎn)，在人類和其他物種同源蛋白相同區(qū)域高度保守不易發(fā)生改變，對(duì)行使蛋白質(zhì)的正常功能具有重要意義。以上結(jié)果均支持 c.962A>G(p.His321Arg)可能為 CLN2 疾病新發(fā)現(xiàn)的致病突變。綜合以上遺傳學(xué)分析得出，TPP1 的復(fù)合雜合突變極有可能導(dǎo)致晚嬰型NCLs。

新生兒篩查是改善目前可治療疾病的早期診斷的最有效方法，有專家建議，用與串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)相兼容的酶底物測(cè)定TPP1活性，可支持未來(lái)大規(guī)模的NBS計(jì)劃[5, 23]。但是新生兒篩查CLN2項(xiàng)目的成功主要依賴于基因型-表型相關(guān)性的清晰性，因此，我們必須共同努力確定TPP1變異所導(dǎo)致的疾病可能性，以便通過(guò)人群篩選和診斷分子遺傳檢測(cè)來(lái)解釋檢測(cè)到的變異。隨著分子遺傳檢測(cè)作為小兒起病神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一線診斷檢測(cè)日益增多，全面的報(bào)告和數(shù)據(jù)共享至關(guān)重要。臨床上發(fā)現(xiàn)TPP1/CLN2突變攜帶者，下一代致病概率較高，建議進(jìn)行早期遺傳咨詢及家系驗(yàn)證。本研究可為該家系遺傳咨詢及再生育指導(dǎo)提供依據(jù)，新突變基因的發(fā)現(xiàn)也擴(kuò)大了該基因的突變譜，為闡明 NCLs 遺傳機(jī)制提供線索和方向。