張麗，羅晶，張義晗，李少平，秦海霞

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 婦科，河南 衛(wèi)輝 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，居女性惡性腫瘤第2 位[1-2]。深入了解宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，鑒定有效診斷及治療的分子標(biāo)志物對宮頸癌防治具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）是一類長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，無蛋白質(zhì)編碼功能[3]。研究證實(shí)，lncRNA 不僅在生物體的多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。宮頸癌相關(guān)功能lncRNA 相繼被報(bào)道，例如lncRNA H19、MEG3、HOTAIR、P12 和CCHE1 等[7-9]。深入研究lncRNA 生物學(xué)功能有助于尋找治療宮頸癌的新靶點(diǎn)，為臨床上宮頸癌的靶向治療和新藥開發(fā)提供新思路。本研究對癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas, TCGA）中宮頸癌組織和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鑒定在宮頸癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNA。對差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行生存分析以鑒定其中具有宮頸癌臨床預(yù)后價(jià)值的lncRNA，并采用生物信息學(xué)方法初步預(yù)測其生物功能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

宮頸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床信息下載自TCGA（https://cancergenome.nih.gov/），共有306 例宮頸癌組織樣本和3 例宮頸癌旁組織樣本。臨床信息包含患者的基本信息、治療情況和預(yù)后信息。人類基因組lncRNA 注釋信息下載自GENCODE 數(shù)據(jù)庫（https://www.gencodegenes.org/）。

1.2 鑒定差異表達(dá)lncRNA

利用lncRNA 注釋文件和TCGA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得15 422 個(gè)lncRNA 的表達(dá)水平信息。為避免低表達(dá)基因產(chǎn)生的背景信號干擾，只保留在90%的樣本中每百萬千基讀取數(shù)（reads per kilobase per million，RPKM）＞0 的基因。采用limma 軟件進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：校正后P＜0.05；差異表達(dá)倍數(shù)變化絕對值＞2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用R3.4.3 軟件進(jìn)行分析。對lncRNA與編碼基因進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r＞0.5為具有表達(dá)相關(guān)性。與lncRNA 共表達(dá)的基因，采用KOBAS 3.0（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）代謝途徑富集分析，采用Benjamini-Hochberg 方法對結(jié)果進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)校正，校正后P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型做生存分析，即差異表達(dá)lncRNA 與宮頸癌患者總體生存率的相關(guān)性，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)lncRNA 的鑒定結(jié)果

從15422 個(gè)lncRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)中剔除低表達(dá)的lncRNA 以避免背景信號的干擾，保留4012 個(gè)lncRNA。limma 軟件比較lncRNA 在宮頸癌組織和宮頸癌旁組織中的表達(dá)水平，鑒定出554 個(gè)在宮頸癌組織和宮頸癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNA，其中309 個(gè)lncRNA 在宮頸癌組織表達(dá)上調(diào)，245 個(gè)下調(diào)（校正后P＜0.05，差異表達(dá)倍數(shù)變化絕對值＞2）。差異倍數(shù)居前20 的lncRNA 見表1。

2.2 差異表達(dá)lncRNA 的預(yù)后分析

利用lncRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)和宮頸癌患者的臨床預(yù)后信息，對上述554 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行生存分析，得到11 個(gè)與患者的總體生存率存在相關(guān)性的lncRNA（P＜0.01），見表2。采用t檢驗(yàn)分析上述11個(gè)lncRNA 的表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示（見表3、4）：LINC00885 的表達(dá)水平與病理類型和脈管浸潤相關(guān)（P＜0.01）；LRRC8C-DT 的表達(dá)水平與臨床分期相關(guān)（P＜0.01）；AC145343.1 的表達(dá)與病理類型相關(guān)（P＜0.01）；ILF3-AS1 的表達(dá)水平與分化程度相關(guān)（P＜0.01）；AL353622.1 的表達(dá)水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理類型相關(guān)（P＜0.01）；LINC02012的表達(dá)水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)（P＜0.01）；AC024337.2 的表達(dá)水平與病理類型相關(guān)（P＜0.01）。

2.3 預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA 靶基因預(yù)測及初步功能預(yù)測

為進(jìn)一步預(yù)測與預(yù)后相關(guān)的lncRNA 的功能，依據(jù)基因表達(dá)水平信息對lncRNA 與編碼基因進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果顯示212 個(gè)編碼基因與上述11 個(gè)lncRNA 存在共表達(dá)關(guān)系。上述212 個(gè)編碼基因用KOBAS 3.0 進(jìn)行KEGG 代謝途徑富集分析，結(jié)果顯示，預(yù)后相關(guān)11 個(gè)lncRNA 涉及的代謝途徑包括環(huán)磷酸鳥苷酸-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶信號通路（cGMP-PKG 信號通路）、血管平滑肌收縮、鈣信號通路、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞間隙連接。見表5。

表1 差異倍數(shù)居前20 的差異表達(dá)lncRNA

表2 與宮頸癌患者總體生存率相關(guān)的lncRNA

續(xù)表2

表3 宮頸癌臨床病理特征與宮頸癌患者總體生存率相關(guān)的5 個(gè)lncRNA 表達(dá)的關(guān)系 （±s）

表3 宮頸癌臨床病理特征與宮頸癌患者總體生存率相關(guān)的5 個(gè)lncRNA 表達(dá)的關(guān)系 （±s）

臨床病理特征 n LINC00885 LRRC8C-DT AC008771.1 ATP2A1-AS1 PAN3-AS1年齡＜50 歲 182 2.25±3.22 0.22±0.16 6.60±3.44 3.99±3.54 0.69±0.43≥50 歲 123 3.09±3.06 0.23±0.15 6.87±3.91 3.84±3.00 0.76±0.63 t 值 2.309 0.501 0.624 0.403 1.069 P 值 0.011 0.309 0.261 0.348 0.126遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0 115 2.67±2.97 0.24±0.16 7.12±3.72 3.85±3.09 0.68±0.39 M1 11 2.16±3.08 0.16±0.13 6.27±4.86 4.49±3.56 0.71±0.26 t 值 0.550 1.683 0.570 0.581 0.284 P 值 0.291 0.051 0.239 0.257 0.418淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0 105 2.66±3.53 0.23±0.14 7.41±3.79 3.67±2.65 0.73±0.62 N1 53 3.78±3.93 0.23±0.14 6.54±3.96 4.28±4.54 0.65±0.44 t 值 1.802 0.304 1.337 1.053 0.789 P 值 0.037 0.381 0.092 0.147 0.216病理類型鱗癌 252 2.77±3.14 0.22±0.15 6.44±3.38 3.93±3.44 0.65±0.37腺癌 27 1.14±2.20 0.24±0.15 7.92±4.84 4.36±2.80 0.83±0.43 t 值 2.633 0.564 2.065 0.629 2.255 P 值 4.464E-03 0.287 0.020 0.265 0.012臨床分期Ⅰ、Ⅱ期 230 2.66±3.28 0.23±0.16 6.71±3.51 3.90±3.11 0.72±0.54Ⅲ、Ⅳ期 69 2.20±2.65 0.18±0.11 6.67±4.09 3.90±4.08 0.68±0.44 t 值 1.041 2.362 0.067 0.004 0.631 P 值 0.149 0.009 0.473 0.498 0.264

續(xù)表3

表4 宮頸癌臨床病理特征與宮頸癌患者總體生存率相關(guān)的6 個(gè)lncRNA 表達(dá)的關(guān)系 （±s）

表4 宮頸癌臨床病理特征與宮頸癌患者總體生存率相關(guān)的6 個(gè)lncRNA 表達(dá)的關(guān)系 （±s）

臨床病理特征 n AC145343.1 ILF3-AS1 AL353622.1 LINC02012 AC024337.2 AC096887.2年齡＜50 歲 182 1.63±1.75 10.33±5.68 1.08±0.99 0.72±0.83 0.08±0.14 0.66±0.47≥50 歲 123 1.33±0.95 10.43±5.90 1.05±0.77 0.73±0.85 0.08±0.21 0.72±0.50 t 值 1.958 0.152 0.341 0.121 0.249 1.001 P 值 0.040 0.439 0.373 0.452 0.394 0.154遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0 115 1.48±1.11 10.97±6.08 1.06±0.77 0.66±0.61 0.08±0.17 0.74±0.57 M1 11 2.64±4.48 10.08±5.08 2.27±2.37 1.23±1.02 0.07±0.11 0.53±0.32 t 值 2.222 0.545 3.843 2.809 0.120 1.894 P 值 0.014 0.320 9.647E-05 0.003 0.467 0.117淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0 105 1.72±1.62 11.04±5.80 1.11±0.97 0.65±0.57 0.08±0.13 0.76±0.57 N1 53 1.50±1.10 11.38±6.83 0.85±0.54 0.78±1.04 0.10±0.26 0.68±0.45 t 值 0.905 0.329 1.789 0.979 0.660 0.914 P 值 0.183 0.371 0.038 0.164 0.255 0.181

續(xù)表4

表5 11 個(gè)lncRNA 靶基因的KEGG 代謝途徑富集分析

3 討論

本研究利用TCGA 中宮頸癌組織及宮頸癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合人類基因組中l(wèi)ncRNA 的注釋信息，剔除低表達(dá)量的lncRNA，共獲得4 012 個(gè)lncRNA的表達(dá)信息。差異表達(dá)分析顯示554 個(gè)lncRNA 在宮頸癌組織和宮頸癌旁組織中差異表達(dá)，也即在宮頸癌組織中異常表達(dá)（其中309 個(gè)lncRNA 在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，245 個(gè)下調(diào)），已報(bào)道的宮頸癌相關(guān)功能lncRNA MEG3[10]、MIR100HG[11]和ANRIL[12]均在上述554 個(gè)差異lncRNA 中。表明lncRNA 的異常表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

生存分析結(jié)果顯示，11 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA 與患者的總體生存率有關(guān)，初步表明上述11 個(gè)lncRNA具有臨床預(yù)后價(jià)值。其中，3 個(gè)lncRNA LRRC8C-DT、ILF3-AS1 和ATP2A1-AS1 已被報(bào)道證實(shí)參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[13-16]。lncRNA LRRC8C-DT 可能通過參與癌癥相關(guān)生物過程在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]；ILF3-AS1 在黑素瘤中表達(dá)上調(diào)，可通過負(fù)調(diào)控miR-200b 促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與黑素瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)[14]，同時(shí)ILF3-AS1 在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌中也出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[14]，并可用于評估結(jié)腸癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[15]；ATP2A1-AS1 可能在人胚胎干細(xì)胞生長和分化中起關(guān)鍵作用[16]。

臨床病理特征相關(guān)性分析顯示LRRC8C-DT、ILF3-AS1 和ATP2A1-AS1 的表達(dá)水平均與宮頸癌的分化相關(guān)；LRRC8C-DT 和ILF3-AS1 的表達(dá)水平與宮頸癌的分期相關(guān)。lncRNA 靶基因的KEGG 代謝途徑富集分析結(jié)果顯示，預(yù)后相關(guān)11 個(gè)lncRNA 涉及的通路包括cGMP-PKG 信號通路、血管平滑肌收縮、鈣信號通路、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞間隙連接。其中cGMP-PKG 信號通路被報(bào)道參與多種腫瘤細(xì)胞的生長，如乳腺癌、結(jié)腸癌等[17-18]；鈣信號通路在癌細(xì)胞循環(huán)過程中發(fā)揮作用[19]；細(xì)胞間隙連接相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化是宮頸癌發(fā)生的重要特征[20]。因此，這些預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA 可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

總之，本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定11 個(gè)與宮頸癌患者總體生存率相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA，進(jìn)一步的臨床病理特征分析和lncRNA 功能預(yù)測提示這些lncRNA 可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。深入分析這些lncRNA，有助于進(jìn)一步闡明宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌的診斷和治療提供分子標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)，從而指導(dǎo)宮頸癌的靶向治療和預(yù)后監(jiān)測。