李光然，邱裕佳，段思騰，馬義勇，李宇，王偉

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，遼寧 沈陽 110016；3.錦州醫(yī)科大學(xué)骨外科學(xué)研究所，遼寧 錦州 121001）

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)的，以感覺、運(yùn)動、意識、自主神經(jīng)功能障礙為主要表現(xiàn)的疾病，是對人類生命危害很大的疾病之一[1]。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的細(xì)胞替代療法已成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新途徑[2]。誘導(dǎo)方法和細(xì)胞來源是細(xì)胞替代療法的2 個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。目前，小分子化合物以其使用便捷性、可控性和功能多樣性等方面的顯著優(yōu)勢，被廣泛用于誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和分化[3]。CHAMBERS 等[4]報(bào)道，2 種Smad 信號通路抑制劑（SB431542+重組Noggin）協(xié)同誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）表達(dá)神經(jīng)外胚層早期標(biāo)志物PAX6 和SOX1，從而實(shí)現(xiàn)類神經(jīng)分化。此誘導(dǎo)方法稱為雙Smad 抑制。而在此誘導(dǎo)分化過程中，加入Wnt 信號通路激活劑CHIR99021 可提高誘導(dǎo)效率，快速、有效地誘導(dǎo)iPSCs 向類神經(jīng)分化[5]。此外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一種成體干細(xì)胞，相比于胚胎干細(xì)胞有不涉及倫理問題的優(yōu)勢，且具有多向分化、來源廣泛、取材相對容易、致瘤風(fēng)險(xiǎn)低的特點(diǎn)[6]。本研究應(yīng)用小分子化合物誘導(dǎo)BMSCs 類神經(jīng)分化并進(jìn)行鑒定，探討其可行性，意在拓展神經(jīng)系統(tǒng)疾病替代療法的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

胎牛血清（德國Sera Pro 公司），DMEM/F12 培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青鏈霉素（美國HyClone 公司），F(xiàn)orskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021（美國Selleck公司），Neurobasal 培養(yǎng)基、B27、NEAA（美國Gibco 公司），表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）（美國PeproTech 公司），L-谷氨酰胺、DAPI 染料（美國Sigma 公司），兔抗CD34 抗體、兔抗CD45 抗體、兔抗CD90 抗體、兔抗CD105 抗體、兔抗NSE 抗體、兔抗Nestin 抗體、兔抗SOX1 抗體及兔抗Actin 抗體（美國Abcam 公司），山羊抗兔二抗（美國Earthox 公司），蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），蛋白Maker、Triton X-100（美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs取4 周齡SD大鼠4 只，無特定病原體（SPF）級，體重（100±10）g/只，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。脫頸處死，于75%酒精中消毒15 min，隨后置于超凈工作臺。無菌條件下分離雙側(cè)股骨和脛骨，以含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液充分吹打至細(xì)胞懸液。以1×109個(gè)/L密度接種至培養(yǎng)皿中，放置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 首次半量換液，72 h 全量換液，以后每2 天全量換液1 次。待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，按1 ∶2 比例傳代。

1.2.2 流式細(xì)胞儀鑒定BMSCs取生長狀態(tài)良好的第3 代BMSCs，制備單細(xì)胞懸液，以1 500 r/min 離心5 min，棄上清，4%多聚甲醛4℃固定30 min，0.1%Triton X-100 室溫通透10 min，加入一抗（CD34、CD45、CD90、CD105），4℃孵育2 h。洗滌2 次，加入熒光素標(biāo)記的二抗，4℃孵育30 min，避光，上機(jī)檢測。

1.2.3 小分子化合物誘導(dǎo)BMSCs 類神經(jīng)分化取生長狀態(tài)良好的第3 代BMSCs，以5×105個(gè)/ml 密度接種于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長到70%后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組和對照組開始誘導(dǎo)。對照組以神經(jīng)元培養(yǎng)基誘導(dǎo)4 d；實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組以預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)1 d，然后以誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)3 d。神經(jīng)元培養(yǎng)基包含DMEM/F12：Neurobasal（1 ∶1） 培養(yǎng)基，1% B27，1%NEAA，1%青/鏈霉素，20 ng/ml EGF，10 ng/ml bFGF，0.2%肝素。預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含：神經(jīng)元培養(yǎng)基，10 μmol/L Forskolin。誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含：神經(jīng)元培養(yǎng)基，0.1 mmol/L 抗壞血酸，2 μmol/L CHIR99021，4 μmol/L DMH1 和4 μmol/L SB431542。誘導(dǎo)方案見表1。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)倒置顯微鏡觀察BMSCs 分離培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)開始后第1、2 及3 天的細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、生長狀況，記錄并采集照片。

1.2.5 免疫熒光鑒定BMSCs 類神經(jīng)分化去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1% Triton X-100室溫通透胞膜10 min，1% BSA 室溫封閉60 min，加入一抗NSE、Nestin，4℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，DAPI 染核5 min，熒光防淬滅劑封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

表1 BMSCs 類神經(jīng)分化誘導(dǎo)方案

1.2.6 Western blotting 檢測特異性蛋白表達(dá)水平提取蛋白樣品并調(diào)整至同等濃度（3 μg/μl），制備10%SDS-PAGE 凝膠，上樣電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，1%BSA 封閉1 h，加入一抗NSE、Nestin、SOX1、β-actin，4℃過夜，加入二抗室溫孵育2 h，ECL 顯色顯影拍照。所得條帶用Image J 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 的鑒定結(jié)果

觀察原代細(xì)胞，多為梭形或多角形，大小不一，換液去除雜質(zhì)細(xì)胞后可見短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長。細(xì)胞傳代后可見伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起，以梭形細(xì)胞為主，細(xì)胞生長旺盛。見圖1。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，第3 代細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD90、CD105 表達(dá)呈陽性，陽性率分別為98.23%、99.27%；而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD34、CD45 表達(dá)呈陰性，陽性率分別為1.09%、0.14%。見圖2。

2.2 BMSCs 誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)

圖1 BMSCs 生長狀態(tài)

誘導(dǎo)第1 天，可見少數(shù)細(xì)胞折光性變強(qiáng)，有較長突起；誘導(dǎo)第2 天，細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，突觸伸長，形成分支，并交織成網(wǎng)，呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，折光性更加明顯；誘導(dǎo)第3 天，突起增多，相互連接成網(wǎng)。見圖3。

2.3 免疫熒光鑒定BMSCs 誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)

將誘導(dǎo)3 d 后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，可見實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組細(xì)胞被神經(jīng)特異性標(biāo)志物NSE、Nestin 標(biāo)記，PBS 對照組未被熒光標(biāo)記。見圖4。

2.4 BMSCs 誘導(dǎo)后特異性蛋白表達(dá)水平

圖2 CD34、CD45、CD90、CD105 陽性率情況

圖3 BMSCs 誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)變化

Western blotting 檢測細(xì)胞神經(jīng)特異性蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：NSE 表達(dá)水平從對照組（0.463±0.154）上調(diào)至實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組（0.918±0.232），Nestin表達(dá)水平從對照組（0.602±0.207）上調(diào)至實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組（1.616±0.337），SOX1 表達(dá)水平從對照組（0.510±0.187）上調(diào)至實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組（1.272±0.328），組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.822、4.443 和3.503，P=0.048、0.011 和0.025）。見圖5。

圖4 神經(jīng)特異性標(biāo)志物表達(dá)

圖5 誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)特異性蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

化學(xué)生物學(xué)是利用活性的小分子化合物干預(yù)蛋白功能和解析生物系統(tǒng)，從而認(rèn)識生物系統(tǒng)的本質(zhì)和內(nèi)在規(guī)律的交叉學(xué)科[7]。小分子化合物能快速誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，時(shí)間上精確可控，作用效果通?？赡?，通過改變小分子的濃度進(jìn)行微調(diào)[8]。與重組蛋白質(zhì)比較，合成的小分子化合物可以更穩(wěn)定、更容易量化、有效性可重復(fù)，并且生產(chǎn)成本要低得多，這對細(xì)胞生產(chǎn)來說尤為重要[9]。

本研究基于小分子化合物作用于特定信號通路的作用特點(diǎn)，采用協(xié)同分步誘導(dǎo)的方式，應(yīng)用小分子化合物誘導(dǎo)BMSCs 類神經(jīng)分化。首先，預(yù)誘導(dǎo)階段使用添加Forskolin 的神經(jīng)元培養(yǎng)基，培養(yǎng)持續(xù)1 d。Forskolin 是腺苷酸環(huán)化酶激活劑，通常用于提高環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和cAMP 效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）水平[10]，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化并促進(jìn)軸突再生[11]。其次，聯(lián)合應(yīng)用小分子化合物SB431542、DMH1 和CHIR99021 協(xié)同誘導(dǎo)BMSCs 類神經(jīng)分化。研究表明，SB431542 和DMH1 可以有效抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路[12]。TGF-β 信號通路是一個(gè)多功能細(xì)胞因子大家族，參與胚胎的發(fā)育及組織、器官的形成與修復(fù)[13]。TGF-β 信號通路可分為TGF-β/Activin/Nodal 和BMP/GDF/MIS 2 個(gè)亞家族通路[14]，被激活后通常引起胚胎干細(xì)胞向中胚層分化。激活該信號通路首先需要TGF-βs 配體分子與受體結(jié)合，從而使受體TβRs 磷酸化，磷酸化的TβR-I 直接作用于Smads 蛋白，活化的Smads 將信號從細(xì)胞膜、胞漿傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞的生物過程[15]。而已有實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)抑制BMP 或敲除Smad4 時(shí)，胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層發(fā)育[16]。研究證實(shí)，DMH1 能夠抑制BMP 信號通路，阻斷下游Smad1、Smad5 和Smad8 磷酸化從而誘導(dǎo)hESCs 神經(jīng)分化[17]；同樣，研究顯示SB431542能夠抑制TGF-β1，阻斷下游的Smad2、Smad3 磷酸化從而增強(qiáng)hESCs 神經(jīng)胚狀體產(chǎn)生[18]。CHAMBERS 等[4]報(bào)告，在細(xì)胞貼壁培養(yǎng)條件下同時(shí)抑制2 種信號通路，足以誘導(dǎo)80%以上的hESCs 實(shí)現(xiàn)快速和完全的神經(jīng)分化。單獨(dú)抑制一種通路時(shí)，神經(jīng)外胚層分化的早期標(biāo)志物PAX6 陽性率低于10%，表明協(xié)同抑制增加神經(jīng)誘導(dǎo)效率。此誘導(dǎo)方法稱為雙Smad 抑制。雙Smad 抑制可能包含以下幾個(gè)潛在機(jī)制，破壞Activin 和Nanog介導(dǎo)的多能網(wǎng)絡(luò)，抑制BMP 誘導(dǎo)hESCs 分化為滋養(yǎng)細(xì)胞譜系[19]，通過抑制Activin 和BMP 信號來抑制hESCs向中/內(nèi)胚層譜系分化[20]，并通過抑制BMP 促進(jìn)神經(jīng)外胚層的分化[21]。

此外，CHIR99021 是一種GSK3-β 抑制劑，能夠激活Wnt/β-catenin 信號通路，推動PAX、SOX1、NGN2 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，作為一種有效的化學(xué)助劑增強(qiáng)神經(jīng)分化[22]。此外，Wnt/β-catenin 是已知的、能夠與Notch 形成復(fù)合物，增強(qiáng)HES1 表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖并抑制其分化[23-24]。因此，Wnt/β-catenin 信號被GSK3β 抑制劑激活，可以直接增強(qiáng)神經(jīng)誘導(dǎo)初始步驟相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并且還可以促進(jìn)誘導(dǎo)分化系統(tǒng)中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

在過去幾年中，BMSCs 已被認(rèn)為是用于細(xì)胞治療和再生重要細(xì)胞來源。BMSCs 具有較高可塑性，在體外和體內(nèi)的適當(dāng)條件下，BMSCs 可以表達(dá)中胚層、外胚層和內(nèi)胚層的多種基因，分別分化為3 個(gè)胚層的多種細(xì)胞類型[25]。最近的研究表明，BMSCs 的神經(jīng)可塑性對治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要作用[26]。本研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)過程中觀察細(xì)胞發(fā)生明顯神經(jīng)樣改變，誘導(dǎo)后表達(dá)NSE、Nestin 和SOX1，結(jié)果表明該組合能夠誘導(dǎo)BMSCs 類神經(jīng)分化。然而，小分子化合物作用于細(xì)胞信號通路的同時(shí)，可能會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。本研究聯(lián)合應(yīng)用小分子化合物（Forskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021）誘導(dǎo)BMSCs 過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正式誘導(dǎo)第2 天，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；第3 天時(shí)發(fā)現(xiàn)大片細(xì)胞凋亡。SURMACZ 等[27]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)分化過程中，當(dāng)DMH1 濃度高于5 μmol/L 時(shí)會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，推測可能是DMH1 影響細(xì)胞內(nèi)其他分子靶點(diǎn)所致。提示不同干細(xì)胞對小分子化合物的濃度敏感性不同，同時(shí)小分子化合物對細(xì)胞的毒性作用是亟待解決的難題。

化合物誘導(dǎo)干細(xì)胞分化有良好的應(yīng)用前景和優(yōu)勢，相比傳統(tǒng)的基因操作方式易于操作、作用可控。但是其分子機(jī)制目前尚不完全清楚，其誘導(dǎo)過程安全性也仍需提高，還需要優(yōu)化小分子化合物組合協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞分化。隨著研究深入，這將會推動再生醫(yī)學(xué)蓬勃發(fā)展，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法帶來深遠(yuǎn)影響。