華法林是目前臨床應(yīng)用最廣泛的口服抗凝藥[1-2]，其臨床證據(jù)堅(jiān)實(shí)充分，適應(yīng)證廣泛，且經(jīng)濟(jì)、易于拮抗；然而，其缺點(diǎn)也顯而易見，如治療窗窄、穩(wěn)態(tài)劑量個(gè)體差異大且易與多種藥物發(fā)生相互作用等[1]。不當(dāng)?shù)慕o藥劑量可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重出血事件發(fā)生[3]。因此應(yīng)用華法林時(shí)需要頻繁監(jiān)測國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）來調(diào)整劑量，以達(dá)到最佳的抗凝效果。許多遺傳和臨床因素與華法林穩(wěn)態(tài)劑量的變異性相關(guān)[4]。大量研究已經(jīng)證實(shí)，基因多態(tài)性，主要包括細(xì)胞色素P4502C9（CYP2C9）和維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1（VKORC1）相關(guān)的突變?cè)谌A法林穩(wěn)態(tài)劑量變異性中起到重要作用[5-7]。

VKORC1的幾種單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（rs7196161，rs9923231，rs9934438，rs8050894和rs2359612）存在高度連鎖不平衡[5]。其中，VKORC1-1639G/A（rs9923231）是重要的基因多態(tài)性位點(diǎn)。與此同時(shí)，迄今已發(fā)現(xiàn)62種CYP2C9等位基因，CYP2C9等位基因在不同人群中的分布存在明顯差異[7]。CYP2C9*3 為亞洲人群最常見的突變類型，而CYP2C9*2 則極為罕見[8]。近年來在漢族人群發(fā)現(xiàn)了多種少見CYP2C9基因突變型，如CYP2C9*13、*16、*36、*39、*43、*45、*60 等，其基因頻率與CYP2C9*2 相當(dāng)，而其功能表達(dá)——CYP2C9 酶的活性在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中被證明較野生型明顯降低[9-11]。繼而可能對(duì)臨床患者的華法林穩(wěn)態(tài)劑量產(chǎn)生潛在影響?，F(xiàn)有的華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型中CYP2C9基因多僅納入CYP2C9*2 和CYP2C9*3 突變作為變量[4,12-14]?；虻漠愘|(zhì)性使得源自其他種族得出的華法林穩(wěn)態(tài)劑量模型無法有效地適用于中國漢族人群。本研究基于漢族人群CYP2C9等位基因分布特點(diǎn)，結(jié)合其他遺傳和非遺傳因素，建立華法林穩(wěn)態(tài)劑量模型，探究除CYP2C9*2 和CYP2C9*3以外的少見CYP2C9等位基因?qū)χ袊鴿h族心房顫動(dòng)（房顫）患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響。

1 資料與方法

選取2011 年1 月至2017 年3 月于北京醫(yī)院就診的中國漢族房顫患者681 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲，滿足抗凝治療適應(yīng)證，同意接受華法林抗凝治療≥3 個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：血壓≥170/110 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），合并活動(dòng)性出血，凝血功能異常、惡性腫瘤以及合并妊娠。隨機(jī)將所納入樣本以2:1 的比例分為建模組（n=454）和驗(yàn)證組（n=227），詳細(xì)記錄患者統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床資料，包括：年齡、性別、身高、體重、吸煙情況、血肌酐水平、合并用藥情況（他汀類藥物、胺碘酮）；以及華法林穩(wěn)態(tài)劑量：即在啟動(dòng)口服華法林治療≥7 d 后，在華法林周給藥劑量不變的情況下，患者至少連續(xù)2 次（間隔至少7～14 d）血INR 處于目標(biāo)范圍（2.0～3.0）時(shí)患者口服華法林的平均日劑量值（mg/d，即周劑量/7 d）[4]。本研究獲得北京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。全部患者簽署知情同意書。

主要試劑：DNA 聚合酶及擴(kuò)增緩沖液（TakaRa公司，日本）；DNA 相對(duì)分子質(zhì)量梯度標(biāo)準(zhǔn)Marker（TakaRa 公司，日本）；PCR 擴(kuò)增引物（北京天一輝遠(yuǎn)生物工程公司）；E.Z.N.A 凝膠回收試劑盒（Omega Biotek 公司，美國）；DTCS QuickStart DNA 測序試劑盒（Beckman Coulter 公司，美國）；蝦堿性磷酸酶（Promega 公司，美國）；核酸外切酶I（NEB 公司，美國）；重組凝血酶原試劑（IL 公司，意大利）。

主要儀器：ABI-9700 型PCR 儀（ABI 公司，美國）；電泳儀及水平電泳槽(北京市六一儀器公司)、凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日公司）、CEQTM8000 測序儀（Beckman Coulter 公司，美國）、UV200 紫外分光光度儀（島津公司，日本）。

DNA 的提?。菏占坷颊咄庵莒o脈血2 ml，以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用鹽析法提取基因組DNA，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。根據(jù)人CYP2C9和VKORC1已知基因組序列及基因多態(tài)性，參照相關(guān)文獻(xiàn)，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）回收純化方式，由北京天一輝遠(yuǎn)生物工程公司合成擴(kuò)增用引物和測序用引物。擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 CYP2C9 和VKORC1 基因擴(kuò)增引物序列

PCR 擴(kuò)增：采用50 μl 的反應(yīng)體系，內(nèi)含：2×Taqmix（包括緩沖液、DNA 聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸）25 μl，100 ng 的基因組DNA 以及0.2 μmol/L 的上、下游引物，加雙蒸水（ddH2O）定容至50 μl。PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后再延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。

DNA 產(chǎn)物測序分析：取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，與4.8 U 蝦堿性磷酸酶及1.5 U 核酸外切酶Ⅰ混合，于37℃反應(yīng)30 min，后85℃維持20 min。將純化后的測序產(chǎn)物放入CEQTM8000DNA 測序儀，輸出測序結(jié)果經(jīng)DNAstar6.0 和Chromas 軟件進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)用SPSS 25.0 軟件分析。采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各等位基因和基因型頻率，χ2檢驗(yàn)確定是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示。主要參數(shù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，如不服從正態(tài)分布，則進(jìn)行自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)；如仍不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。各組間等位因與基因型頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。組間華法林劑量平均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量資料與華法林劑量的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。采用單因素線性回歸分析篩選與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)的遺傳和臨床變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，建立預(yù)測方程。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基線特征（表2）

681 例患者中男性458 例，女性223 例，平均年齡（68.0±10.2）歲。用藥情況方面，單獨(dú)應(yīng)用華法林403 例（59.2%），合并使用華法林和他汀類藥物120 例（17.6%），合并使用華法林和胺碘酮122例（17.9%），合并使用華法林、他汀類藥物和胺碘酮36 例（5.3%）。華法林穩(wěn)態(tài)劑量范圍為0.50～9.00 mg/d，平均穩(wěn)態(tài)劑量為（3.34±1.18）mg/d。

2.2 CYP2C9 和VKORC1-1639 基因多態(tài)性對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響

經(jīng)檢驗(yàn)，研究人群CYP2C9和VKORC1-1639等位基因及基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律，具有群體代表性。

CYP2C9*1/*3 是研究群體中最常見CYP2C9的突變基因型，占9.3%，攜帶者平均華法林穩(wěn)態(tài)劑量為（2.30±0.88）mg/d，顯著低于野生型CYP2C9*1/*1[（3.47±1.13）mg/d，P＜0.001]。CYP2C9*1/*2 和CYP2C9*3/*3 基因型攜帶者各1例，穩(wěn)態(tài)劑量分別為2.50 mg/d 和0.50 mg/d。除CYP2C9*2 和CYP2C9*3 以外，本研究發(fā)現(xiàn)了6 種少見CYP2C9等位基因突變，包括CYP2C9*7、*13、*16、*29、*33、*16，均為雜合子，基因型頻率為0.92%。其中3 種突變（CYP2C9*13、*16、*60）攜帶者的臨床和藥物遺傳學(xué)信息被完整獲取。這三種其他少見基因型CYP2C9*1/*13、CYP2C9*1/*16、CYP2C9*1/*60 平均華法林穩(wěn)態(tài)劑量分別為（1.88±0.53） mg/d、1.39 mg/d、（1.00±0.35）mg/d，均低于CYP2C9*1/*1 及CYP2C9*1/*3 均值（P均＜0.05）。將CYP2C9*1/*13、*16、*60 合并為變量CYP2C9（13/16/60），平均華法林穩(wěn)態(tài)劑量為（1.42±0.54）mg/d，顯著低于CYP2C9*1/*1（P＜0.001）及CYP2C9*1/*3（P＜0.05）。

對(duì)VKORC1-1639G/A 基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，AA 是主要的基因型，占總樣本數(shù)的78.7%，GA 雜合子占總樣本數(shù)的19.1%，GG 純合子占總數(shù)的2.2%。AA 組華法林穩(wěn)態(tài)劑量最低，為（3.07±0.87）mg/d，顯著低于 GA 組[（4.27±1.37）mg/d]和GG 組[（5.59±1.84）mg/d]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。

2.3 CYP2C9 和VKORC1-1639 不同基因型組合對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響（表3）

將樣本人群按照CYP2C9與VKORC1-1639G/A不同基因型組合進(jìn)行分組，可以發(fā)現(xiàn)野生型基因型組合CYP2C9*1/*1 ＋VKORC1-1639AA 最為常見，占69.5%，平均華法林穩(wěn)態(tài)劑量為（3.18±0.82）mg/d。各基因型組合穩(wěn)態(tài)劑量與野生型組合相比較后的P值見表3。對(duì)于特定的CYP2C9基因型，華法林穩(wěn)態(tài)劑量均值由VKORC1-1639AA 基因型至GA 型至GG 型逐漸升高。而對(duì)于特定的VKORC1-1639AA 基因型，CYP2C9突變型[*1/*3、*3/*3、CYP2C9（13/16/60）]的穩(wěn)態(tài)劑量均值均低于野生型CYP2C9*1/*1（P均＜0.01）。

表2 681 例患者的基線特征（）

表2 681 例患者的基線特征（）

注：*：體表面積計(jì)算參照Stevenson's 公式，即：體表面積（m2）＝0.0061×身高（cm）＋0.0128×體質(zhì)量（kg）－0.1529

表3 681 例患者不同基因型組合華法林穩(wěn)態(tài)劑量情況（）

表3 681 例患者不同基因型組合華法林穩(wěn)態(tài)劑量情況（）

注：CYP2C9：細(xì)胞色素P450 2C9；VKORC1：維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1。與CYP2C9*1/*1＋VKORC1-1639AA 比△P＜0.01

2.4 公式建立

對(duì)建模組454 例患者的遺傳和非遺傳變量進(jìn)行單因素回歸分析，其中體表面積、合并使用胺碘酮、CYP2C9*3、CYP2C9（13/16/60）、VKORC1-1639GA、VKORC1-1639GG 均被發(fā)現(xiàn)與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)（P均＜0.001）。其中，胺碘酮、CYP2C9*3、CYP2C9（13/16/60）與華法林穩(wěn)態(tài)劑量之間呈負(fù)相關(guān)；體表面積、VKORC1-1639GA，VKORC1-1639GG 這3 個(gè)變量則與華法林穩(wěn)態(tài)劑量呈顯著性正相關(guān)。其余變量經(jīng)初步分析與華法林穩(wěn)態(tài)劑量之間的相關(guān)性均不顯著（P均＞0.05）。將上述6 個(gè)變量進(jìn)一步納入多元回歸模型，進(jìn)行分步回歸分析，建立華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型，得到回歸方程：華法林日劑量＝exp[0.524＋0.344×體表面積－0.082×胺碘酮-0.393×CYP2C9*3-0.740×CYP2C9（13/16/60）+0.276×VKORC1-1639GA+0.593×VKORC1-1639GG]R2=44.3%。本模型預(yù)測權(quán)重達(dá)44.3%，遺傳因素的總預(yù)測權(quán)重達(dá)39.6%。由表4 可見，CYP2C9*3 是最重要的預(yù)測因子，可解釋15.8%的劑量差異，而CYP2C9（13/16/60）占總基因頻率的0.7%，可以解釋6.3%的華法林劑量個(gè)體差異，VKORC1-1639G/A 共可解釋17.5%的華法林穩(wěn)態(tài)劑量個(gè)體差異。

表4 華法林穩(wěn)態(tài)劑量多元線性回歸模型

2.5 模型的驗(yàn)證

將驗(yàn)證組的227 例患者的臨床及遺傳信息代入本研究所建立的華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型，進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析（圖1）。本研究建立模型得到的相關(guān)系數(shù)r=0.567，其中55.5%的樣本預(yù)測劑量與實(shí)際劑量的偏差小于20%。

圖1 驗(yàn)證組中華法林預(yù)測劑量與實(shí)際劑量關(guān)系

3 討論

CYP2C9所編碼的細(xì)胞色素P450 酶是更具藥理活性的S-華法林消旋體代謝的關(guān)鍵酶。目前已發(fā)現(xiàn)62 種CYP2C9等位基因，CYP2C9等位基因在不同人群中的分布有著明顯差異[7]。CYP2C9*3 是亞洲人群中最常見的等位基因突變，基因頻率為2%～8%，而CYP2C9*2 則極為罕見[8]。本研究中CYP2C9*3 和CYP2C9*2 的基因頻率與既往國內(nèi)報(bào)道的基因頻率相當(dāng)[14-15]。CYP2C9基因多態(tài)性在華法林穩(wěn)態(tài)劑量個(gè)體差異中發(fā)揮著重要的作用，本研究中CYP2C9*3 是最重要的遺傳預(yù)測變量，其可解釋約15.8%華法林穩(wěn)態(tài)劑量變異性。

近年來，除CYP2C9*2 和CYP2C9*3 以外的少見CYP2C9基因型在華法林穩(wěn)態(tài)劑量中的影響越來越受到重視。CYP2C9*5、*6、*8、*11 是其中研究最多的少見CYP2C9突變基因，并與低華法林穩(wěn)態(tài)劑量密切相關(guān)[16-17]。它們?cè)诜侵奕巳褐凶顬槌Ｒ?，基因頻率可高達(dá)約8%～10%，但在東亞人群中卻極為罕見[8,18]。在一項(xiàng)研究中，將少見基因突變CYP2C9*5、*6、*8、*11 納入華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型，可增加了6%的華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測權(quán)重[19]。基于上述證據(jù)，2017 年臨床藥物基因組學(xué)實(shí)施聯(lián)盟（CPIC）指南推薦，對(duì)于CYP2C9*5、*6、*8、*11 基因突變的攜帶者，應(yīng)下調(diào)其初始華法林劑量15%～30%[1]。

目前國內(nèi)尚未有將除CYP2C9*2 和CYP2C9*3以外的少見CYP2C9等位基因作為變量納入華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型的報(bào)道。本研究共發(fā)現(xiàn)了CYP2C9*7、*13、*16、*29、*33、*60 共6 種少見CYP2C9等位基因，均為雜合子，上述突變基因頻率均與CYP2C9*2 相當(dāng)。國內(nèi)2013～2015 年發(fā)表的幾項(xiàng)研究[8-11]，建立了漢族人群中最大的CYP2C9等位基因數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了除CYP2C9*2 和CYP2C9*3 以外的36 種CYP2C9等位基因，總等位基因頻率達(dá)2.44%，其中27 種等位基因在體外實(shí)驗(yàn)中代謝活性較野生型明顯降低，包括本研究中發(fā)現(xiàn)的CYP2C9*13、*16 和*60。CYP2C9*13 在2004 年首次于中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)[20]，是中國人群中較為常見的少見CYP2C9等位基因，基因頻率達(dá)0.16%～0.70%[8,21]。多項(xiàng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，CYP2C9*13 與更低的藥物代謝活性相關(guān)[22-23]。此外臨床上也發(fā)現(xiàn)帶有CYP2C9*13 等位基因的個(gè)體有著更低華法林劑量需求[24]。CYP2C9*16 最早于2004 年在東南亞人群中被發(fā)現(xiàn)[25]。戴大鵬等[8]2013年的研究報(bào)道，CYP2C9*16 在漢族人群基因頻率為0.19%。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)證明，CYP2C9*16與更低的藥物代謝活性相關(guān)[9,15,26]。CYP2C9*60 首次于2015 年在對(duì)1 例極低華法林穩(wěn)態(tài)劑量患者的研究中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明，它與更低的藥物代謝活性相關(guān)[11]。本研究中6 種其他少見CYP2C9等位基因總基因型頻率約為0.92%，低于戴大鵬等的報(bào)道。其中3 種少見基因突變（CYP2C9*13、*16、*60）攜帶者的臨床和遺傳信息被完整獲取，并證實(shí)相關(guān)突變與低的華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)。根據(jù)漢族人群中CYP2C9等位基因特點(diǎn)，綜合CYP2C9*13、*16、*60 三種少見基因型，我們建立了變量CYP2C9（13/16/60），平均穩(wěn)態(tài)劑量顯著低于CYP2C9*1/*1（P＜0.001）及CYP2C9*1/*3（P＜0.05）。這可能預(yù)示攜帶這些等位基因的患者有著更低的華法林劑量需求，按常規(guī)劑量給藥可能會(huì)導(dǎo)致出血風(fēng)險(xiǎn)增高。CYP2C9（13/16/60）基因型頻率共占0.7%，但可以解釋6.3%的華法林劑量個(gè)體差異。盡管少見CYP2C9等位基因的基因頻率較少，但考慮到中國有著約13 億漢族人口，以及它們對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)劑量的顯著影響，研究少見CYP2C9等位基因?qū)θA法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響對(duì)指導(dǎo)中國漢族房顫患者華法林個(gè)體化給藥具有重要的意義。

VKORC1所編碼的維生素K 環(huán)氧化物是維生素K 循環(huán)的關(guān)鍵酶和華法林作用的靶點(diǎn)[5]。rs9923231（-1639G＞A）是常見的VKORC1基因多態(tài)性。VKORC1基因多態(tài)性與種族相關(guān)，亞洲人群中AA 基因型頻率最高達(dá)86%，其次是歐洲人達(dá)37%，最低是非洲人達(dá)10%[5-6]；而GG、GA 與更高的華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)[5]。這可能是亞洲人華法林穩(wěn)態(tài)劑量較低的部分原因。本研究證實(shí)了以上發(fā)現(xiàn)，VKORC1-1639G/A 共可解釋17.5%的華法林穩(wěn)態(tài)劑量個(gè)體差異。本研究所建立模型中遺傳因素的總預(yù)測權(quán)重達(dá)39.6%。

臨床因素中，體表面積及胺碘酮的使用被納入模型，其中體表面積與華法林穩(wěn)態(tài)劑量呈正相關(guān)，而合并使用胺碘酮與華法林穩(wěn)態(tài)劑量呈負(fù)相關(guān)。研究表明，胺碘酮及其代謝產(chǎn)物可能通過抑制CYP2C9 酶系統(tǒng)，減少華法林的代謝，從而降低華法林的穩(wěn)態(tài)劑量[27]。

本研究納入了681 例服用華法林預(yù)防血栓事件并達(dá)到穩(wěn)態(tài)劑量的患者?；谒幬镆蚪M學(xué)、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床資料，使用逐步回歸分析，在漢族人群中首次將除CYP2C9*2 和CYP2C9*3 以外的其他少見CYP2C9基因突變作為變量，建立中國北方漢族房顫患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測模型，預(yù)測權(quán)重達(dá)44.3%。將得到的模型應(yīng)用于驗(yàn)證組，結(jié)果優(yōu)于國內(nèi)外IWPC 模型[4]、Gage 模型[12]、Ohno 模型[13]和Miao 模型[14]。新模型未來如推廣到臨床，在指導(dǎo)和預(yù)測華法林的給藥劑量、縮短INR 達(dá)標(biāo)時(shí)間以及降低華法林過量風(fēng)險(xiǎn)等方面可能較現(xiàn)有的模型更具優(yōu)勢，當(dāng)然這還需要進(jìn)一步前瞻性臨床試驗(yàn)的證實(shí)。

局限性：（1）發(fā)現(xiàn)少見CYP2C9基因例數(shù)較少，據(jù)此建立的模型方程難免存在偏倚，仍有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，把更多其他少見CYP2C9基因納入模型，優(yōu)化方程，探究對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響。（2）遺傳因素僅納入了CYP2C9和VKORC1基因，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，其他遺傳因素如CYP4F2、CYP2C19、GGCX、EPHX1、CALU等也與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)[1,28-29]。（3）臨床因素中僅有體表面積和胺碘酮的使用被納入模型，預(yù)測權(quán)重低于國內(nèi)外其他研究模型[12-14]，以后還可以通過優(yōu)化樣本結(jié)構(gòu)、豐富更多的臨床信息，進(jìn)一步完善模型。（4）本研究屬于回顧性研究，其結(jié)果還需要前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突